光學(xué)對(duì)比法使人們有可能借助生物顯微鏡輕松檢查活的和無色的標(biāo)本。不同的顯微技術(shù)旨在將由光與樣品的相互作用引起的相移改變?yōu)檎穹兓?，人眼可以看到振幅變化?/span>

明場(chǎng)顯微鏡通常只能提供未染色標(biāo)本的較弱圖像，其中只有少量細(xì)節(jié)可以檢測(cè)到。強(qiáng)烈的對(duì)比度對(duì)于查看圖片中的更多細(xì)節(jié)很重要。增強(qiáng)對(duì)比度的一種方法是對(duì)樣品染色。但是，由于這對(duì)于活生物體來說是不可能的，因此它們保持不變色并且顯得不起眼。這些樣本實(shí)際上也在光學(xué)顯微鏡中與入射光相互作用。然而，發(fā)生了人眼無法檢測(cè)到的相移。眼睛只能感覺到振幅（亮度）和頻率（顏色）的變化。

 對(duì)比度是指區(qū)分樣本和背景并發(fā)現(xiàn)樣本中細(xì)節(jié)的可能性。定義為圖像與相鄰背景之間的光強(qiáng)度與總背景強(qiáng)度的差。對(duì)于人眼，這些差異必須至少為百分之二才能被檢測(cè)到。使用光電探測(cè)器可以實(shí)現(xiàn)巨大的改進(jìn)。

 但是，對(duì)比度不僅取決于樣品及其與光本身的相互作用。用于觀察標(biāo)本的光學(xué)系統(tǒng)及其記錄圖像信息的能力也很關(guān)鍵。在顯微系統(tǒng)中，對(duì)比度取決于正確的光圈設(shè)置，光學(xué)像差的等級(jí)，所使用的對(duì)比度方法，樣本和檢測(cè)器。

 因此，通過改變光圈的光圈設(shè)置，可以獨(dú)立于對(duì)比度方法而影響用光學(xué)顯微鏡獲取的圖像的對(duì)比度。但是，例如如果聚光鏡停止得太遠(yuǎn)，則分辨率會(huì)受損，并且可能會(huì)出現(xiàn)衍射偽像。

 獲得足夠?qū)Ρ榷鹊淖罟爬戏椒赡苁窍葘?duì)樣品染色。通常，這僅適用于死物質(zhì)，并偶爾需要一些復(fù)雜的染色方案。如果要觀察活細(xì)胞，則不容易染色。因此，由適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)顯微鏡提供的不同技術(shù)旨在將由光與樣本的相互作用引起的相移改變?yōu)榉绕啤?/span>

 相位對(duì)比和微分干涉對(duì)比（DIC）是這些對(duì)比方法的示例。其他光學(xué)對(duì)比方法是暗場(chǎng)和偏振對(duì)比。

兔子味蕾斷面，相差顯微鏡

兔子味蕾斷面，微分干涉對(duì)比顯微鏡

兔子味蕾斷面，明場(chǎng)顯微鏡

光線與標(biāo)本之間的相互作用

如果入射光照射到標(biāo)本上，它們將相互作用。吸收，反射，衍射，光散射和折射都是可能的后果。在此過程中，醒目的光波發(fā)生了變化。相移以及幅度變化都是可能的。

 在這一方面，可以區(qū)分相位和幅度對(duì)象。理想地描述，相位對(duì)象是改變相位但不改變光波幅度的樣本。相反，振幅對(duì)象僅影響光的振幅，而不影響光的相位。扁平且未染色的細(xì)胞幾乎達(dá)到了可見光相位對(duì)象的特性。由于它們僅導(dǎo)致人眼無法看到的相移，因此它們?cè)诿鲌?chǎng)顯微鏡下的對(duì)比度非常低。振幅對(duì)象本身可以在明場(chǎng)顯微鏡中很好地成像。它們降低了振幅，從而降低了穿過的光的強(qiáng)度。

 染色或自然著色的物體可以在明亮的視野中很好地顯示。它們屬于振幅對(duì)象。它們減少了通過的光，因此減小了波前的幅度。但是它們不是理想的振幅對(duì)象。除了振幅外，它們還影響照射光的成分。它們吸收或反射具有不同頻率的波，而其他波長(zhǎng)的光可以不受阻礙地穿過。

 由于樣品和周圍介質(zhì)的折射率不同，會(huì)發(fā)生相移。如果光波進(jìn)入單元，它將被準(zhǔn)減速，而振幅將保持不變。當(dāng)光離開細(xì)胞時(shí)，它恢復(fù)速度并以與以前相同的頻率，波長(zhǎng)和幅度穿過介質(zhì)。然而，與僅穿過介質(zhì)的光相比，其相位已經(jīng)發(fā)生了變化。

 鑒于人眼和其他光學(xué)檢測(cè)器無法識(shí)別和檢測(cè)光波的相移，在未染色和未著色樣品的情況下，對(duì)比方法的主要目的是產(chǎn)生振幅對(duì)比并將相位對(duì)比轉(zhuǎn)換為幅度對(duì)比。

對(duì)生物學(xué)研究的巨大影響

與使用固定和沾染的物體相比，使用未染色的標(biāo)本具有許多優(yōu)勢(shì)。它允許在沒有固定物和染色偽影的生物顯微鏡下觀察活體。固定和染色會(huì)例如使樣品收縮或膨脹。此外，存在破壞細(xì)胞中不同結(jié)構(gòu)或?qū)嵸|(zhì)上改變其形態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)。消除這種危險(xiǎn)的唯一肯定的方法是使用沒有偽影并提供可靠和真實(shí)信息的活體樣品。活細(xì)胞顯微鏡檢查的另一個(gè)巨大優(yōu)勢(shì)是可以檢查與時(shí)間有關(guān)的情況。除了獲得細(xì)胞的靜態(tài)信息及其狀況的快照之外，還可以輕松監(jiān)控整個(gè)過程，例如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞分裂以及細(xì)胞凋亡。

 從不同的光學(xué)對(duì)比方法獲得的信息和印象取決于其來源。因此，建議依靠不同對(duì)比技術(shù)的組合來獲得所檢查樣本的最準(zhǔn)確和最詳細(xì)的圖像。盡管明場(chǎng)通常無法準(zhǔn)確觀察細(xì)胞的形態(tài)，但其他光學(xué)對(duì)比方法可能會(huì)提供進(jìn)一步的見解。

 通過將熒光標(biāo)記添加到細(xì)胞的實(shí)時(shí)圖像中可以獲得更多信息?？梢杂脽晒獾鞍祝ㄈ鏕FP）標(biāo)記細(xì)胞中感興趣的蛋白。然后可以通過光學(xué)顯微圖像追蹤并精確確定其在細(xì)胞內(nèi)部的定位。也存在將GFP與肽定位信號(hào)偶聯(lián)的可能性。這樣，可以看到像內(nèi)質(zhì)網(wǎng)這樣的不同隔室。

 用于研究的現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡通常采用模塊化設(shè)計(jì)，從而可以在各個(gè)對(duì)比方法之間或什至同時(shí)應(yīng)用時(shí)快速切換。光學(xué)對(duì)比方法使人們有可能在日常的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作中輕松檢查活的和無色的標(biāo)本。