應(yīng)用驅(qū)動型qPCR儀選型攻略-2

二、在等溫循環(huán)模塊qPCR儀上優(yōu)化PCR反應(yīng)的有效途徑
        eppendorf、MJ Research和伯樂等是梯度溫度qPCR儀路上的先行者。ABI是在2007年VeriFlex模塊投產(chǎn)后才步入梯度時代，StepOne和StepOnePlus是其標(biāo)志。在梯度溫度模塊大規(guī)模應(yīng)用前，科學(xué)家們手里的普通終點式PCR儀和實時熒光定量PCR儀，都配的是等溫循環(huán)模塊。
        死了張屠戶，要吃渾毛豬。沒有梯度溫控模塊，科學(xué)家們并非在復(fù)雜模板擴(kuò)增時束手無策，或為摸索有效退火溫度就只能進(jìn)行N輪擴(kuò)增實驗。
        實際上，早在1991年，一套行之有效的PCR優(yōu)化方法-降落PCR技術(shù)（touchdown PCR，TD-PCR）就誕生了。TD-PCR技術(shù)是與常規(guī)緩沖液組份濃度、循環(huán)條件和在梯度模塊上改變退火溫度等常規(guī)優(yōu)化策略完全不同的提高PCR反應(yīng)特異性的方法。
        其工作原理是：在PCR初始階段，退火溫度高于估計Tm值，此時擴(kuò)增效率低但可避免非特異性PCR產(chǎn)物產(chǎn)生。隨著循環(huán)進(jìn)行，退火溫度遞減，當(dāng)“降落”至引物-模板結(jié)合最佳溫度時（通常比Tm低3-5℃），特異性擴(kuò)增開始。隨后退火溫度進(jìn)一步降低，特異性擴(kuò)增與非特異擴(kuò)增齊飛。但憑借先發(fā)優(yōu)勢，經(jīng)過2個循環(huán)擴(kuò)增，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物已實現(xiàn)絕對的數(shù)量優(yōu)勢，對任何其后出現(xiàn)的非特異擴(kuò)增產(chǎn)生強(qiáng)烈競爭抑制而處于單一主導(dǎo)地位，確保了在剩余進(jìn)程PCR擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。
        經(jīng)典TD-PCR程序編輯方法是：從高于引物-模板退火溫度熔解溫度（Tm）值開始，到退火溫度低于Tm值若干為止的范圍，按每個步驟重復(fù)2次、相鄰的2X步驟退火溫度依次比上一個2X步驟遞減1-2℃，直到退火溫度設(shè)定底限為止的方法，設(shè)置熱循環(huán)程序前面2N個連續(xù)循環(huán)步驟。從2N+1開始的剩余循環(huán)統(tǒng)一按第2N步驟參數(shù)執(zhí)行。

        以2010年J Nucleic Acids刊文中的TD PCR程序為例：
Stage 1：95℃預(yù)變性30s;
Stage 2：95℃變性30s→56℃退火30s→72℃延伸1min
Stage 3：每個循環(huán)退火溫度降低2℃,從56℃降落到46℃共5個循環(huán);
Stage 4：95℃變性30s,44℃退火30s,72℃延伸1min,完成余下29個循環(huán)
Stage 5：72℃延伸10mn;
總計35個循環(huán)。
        TD-PCR在配置等溫?zé)嵫h(huán)模塊的普通PCR儀和實時熒光定量PCR儀上就可以實施。同一批常規(guī)樣品、同一臺機(jī)器同一個運行程序，只需一次運行即可完成特異性擴(kuò)增。
        TD-PCR方法作為基本功能，很早就被融入主流廠商PCR、qPCR儀的程序編程環(huán)節(jié)。如Agilent SureCycler 8800 PCR儀，設(shè)有專門Touchdown PCR設(shè)置選項。只是不同機(jī)型TD-PCR編程操作界面及簡易程度有別。

        目前，Applied Biosystems旗下的qPCR儀，無論是否配置梯度溫度模塊，都采用了AutoDelta選項專用于Touchdown PCR編程設(shè)置。如QuantStudio 6 Pro/6 Flex、QuantStudio 7 Pro/7 Flex實時熒光定量PCR儀，在退火步驟編程界面設(shè)有Enable AutoDelta選型（圖中藍(lán)色箭頭所示）。
 

        激活選項后會彈出AutoDelta設(shè)定界面。指定TD步驟起點、TD溫度降幅和時間遞變幅度、每個溫度重復(fù)次數(shù)即可，程序設(shè)定操作簡便。

         伯樂CFX Opus 96、CFX Duet、CFX 96 touch等qPCR儀在觸摸屏、PC操作端的編程界面中都有GOTO功能，可用作TD程序設(shè)定。

        點擊Insert選項，選擇在圖中95℃-10sec位置依次用Insert Step命令插入退火參數(shù)、延伸步驟參數(shù)、讀板，以GOTO命令設(shè)置重復(fù)步驟起點、循環(huán)次數(shù)完成第一個TD設(shè)置。此后在第一TD步驟之后依次插入第二步TD變性、退火、延伸、讀板和GOTO步驟完成第二個TD設(shè)置，以此類推完成整個TD程序設(shè)置。
        TD-PCR特殊的特異性擴(kuò)增優(yōu)勢，可在非特異性背景極高情況下特異性的PCR表現(xiàn)及擴(kuò)增物的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)。特別適用于常規(guī)PCR循環(huán)程序難以克隆的復(fù)雜基因組DNA模板的擴(kuò)增，在同時使用幾種非特異性引物情況下還成功地從基因組DNA中擴(kuò)增出目的擴(kuò)增子，證明TD-PCR超凡的抗干擾能力。國內(nèi)外將TD-PCR應(yīng)用于STR標(biāo)記遺傳鑒定、基因多態(tài)性分布、啟動子的克隆及表達(dá)研究、多重降落PCR檢測的案例多至難以枚舉。有人還將采用TD-PCR方法的qPCR實驗命名為TD-qPCR。

三、實時熒光定量PCR實驗反應(yīng)條件再優(yōu)化的必要性
        MQIE指南規(guī)定qPCR實驗應(yīng)標(biāo)明完整反應(yīng)條件、qPCR品牌型號信息及熱循環(huán)詳細(xì)參數(shù)。而實驗的外部環(huán)境（如地理位置、海拔高度、氣候條件、實驗環(huán)境）和內(nèi)部條件（如qPCR儀型號和模塊配置、反應(yīng)體系組成和體積等）都制約PCR熱循環(huán)模塊的溫控實效表現(xiàn)。而qPCR儀擴(kuò)增模塊變溫特征不同會影響實驗結(jié)果的一致性?，F(xiàn)實條件下的兩個獨立實驗中，要使儀器溫控性能狀態(tài)一致、實驗結(jié)果精準(zhǔn)重現(xiàn)，難度超乎想象。
        將普通PCR反應(yīng)擴(kuò)增參數(shù)跨平臺植入到實時熒光定量PCR實驗中運行，是前提條件的，即普通PCR儀熱循環(huán)模塊和qPCR配置反應(yīng)模塊同款。如將C1000 Touch 96-Well Fast PCR儀的參數(shù)嵌入CFX96 Touch qPCR儀可以考慮，因為后者擴(kuò)增模塊正是C1000 Touch 96-Well Fast模塊。但若將Mastercycler pro梯度模式下所得參數(shù)嵌入7500、QuantStudio 1或QuantStudio 6 Flex的運行程序，因彼此間控溫特性截然不同，此方法固不可取。
        qPCR實驗不僅包含普通PCR反應(yīng)全部要素，還疊加了熒光檢測條件和性能差異。何況，同一個模板添加SYBR Green l熒光染料、Taqman探針、FRET雜交探針后的qPCR反應(yīng)與常規(guī)普通PCR反應(yīng)，最適退火溫度是否發(fā)生變化，缺少足夠硬核支持證據(jù)，尚無定論。因此，qPCR實驗參考前人條件基礎(chǔ)上，關(guān)鍵還是基于實際qPCR儀性能進(jìn)行必要的條件驗證優(yōu)化，這本是qPCR實驗內(nèi)在規(guī)律的必然要求。
        實時熒光定量PCR儀，無論是配置梯度溫度功能模塊的StepOnePlus、QuantStudio 3、QuantStudio5、QuantStudio 6 Pro、QuantStudio 7 Pro等，以及伯樂的CFX Duet、CFX Opus 96/Opus 384、CFX96/CFX384 Touch，還是采用等溫反應(yīng)模塊機(jī)型QuantStudio 1、QuantStudio 6 Flex、QuantStudio 7 Flex、7500 Fast，在軟件編程環(huán)節(jié)，都兼顧了常規(guī)引物退火溫度梯度編程和TD-PCR程序編輯功能。不僅可自由設(shè)定反應(yīng)步驟、每步溫度、保持時間、是否采集熒光信號等基本參數(shù)，還提供了梯度退火溫度、AutoDelta（GOTO重復(fù)循環(huán)）等高級編輯功能選項，便于量身創(chuàng)建高效可靠的qPCR實驗運行程序。

四、qPCR反應(yīng)條件再優(yōu)化需求對實時熒光定量PCR儀選型的指導(dǎo)意義
        梯度溫度控制和Touchdown降落PCR是PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化工作中的常用技術(shù)手段。
        TD-PCR特異性高，善于應(yīng)對復(fù)雜反應(yīng)體系、模板的擴(kuò)增。模塊溫控均一性好，則擴(kuò)增過程中樣品變溫步調(diào)一致，無需糾結(jié)于退火溫度的準(zhǔn)確值。實驗者根據(jù)引物序列條件制定退火溫度的上、下限范圍（以40℃-65℃常見）后，據(jù)溫度遞減幅度（1℃-3℃居多）確定具體Touchdown臺階數(shù)量和每個降落臺階重復(fù)次數(shù)（1X-3X為主）。在目前多數(shù)PCR儀、qPCR系統(tǒng)上都可以實現(xiàn)，操作簡便，可重復(fù)性好。編程界面直觀簡便程度因品牌機(jī)型而異。從調(diào)研結(jié)果看，QuantStudio系列機(jī)型TD編程要更簡便。
        梯度溫度優(yōu)化技術(shù)，有其固有局限性，“算法模擬”退火溫度和實際溫度游離，始終處于模糊狀態(tài)，適度縮窄退火范圍，縮小算法溫度梯度落差，可提高梯度溫度示值的可信性。雖是后起之秀，但編程設(shè)置實現(xiàn)傻瓜化。廠商以此為賣點競相宣揚，熱捧之下很快成了家喻戶曉的流量明星，風(fēng)頭蓋過TD-PCR。所謂新人勝舊人，發(fā)展到言PCR必稱溫度梯度的地步。但技術(shù)本身的顏值，春華秋實，如此而已。
        關(guān)于qPCR實驗條件再優(yōu)化必要性和有效途徑的探討，對制定實時熒光定量PCR儀選型方略的啟示在于：
        首先，在PCR編程智能化背景下，TD運行程序設(shè)置已極大簡化。選型時應(yīng)視野開闊、兼容并蓄、博采眾長，不能完全為實驗習(xí)慣和唯梯度論所囿。

        其次，因地制宜，基于實驗室PCR條件資源，多考慮如何創(chuàng)造有利條件，實現(xiàn)運行參數(shù)在普通PCR儀和實時熒光定量PCR儀間的跨平臺有效銜接。
        譬如，就現(xiàn)有伯樂C1000 touch 96-well Fast考慮與CFX-96 touch qPCR的對接，而Veriti Pro 96-Well (96×0.2ml，6.5℃/s)可以嘗試與QuantStudio 3、QuantStudio 5、QuantStudio 6 Pro/6 Flex、QuantStudio 7 Pro/7 Flex等幾款配置有96×0.2ml、6.5℃/s規(guī)格veriFlex模塊的定量PCR配套使用。舊Veriti (96×0.1ml，5.0℃/s) 擴(kuò)增儀與StepOne Plus (96×0.1ml，6.5℃/s)，雖然都采用的是96×0.1ml的veriFlex模塊，但最大升溫速度(5.0℃/秒VS 6.5℃/秒)和平均變溫速度(4.25℃/秒VS 2.2℃/秒)存在明顯差異，運行參數(shù)銜接后擴(kuò)增效果可能難以做到盡如人意。
        從目前看，行業(yè)頭部廠商顯然已意識到新上市產(chǎn)品的PCR模塊間的有效兼容，對于實驗運行協(xié)議跨平臺轉(zhuǎn)移的重要性。這似乎代表著實時熒光定量PCR儀的一個發(fā)展趨勢。

參考文獻(xiàn)
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[6] Agilent SureCycler 8800安裝和用戶指南C2版(2015年10月)