應(yīng)用驅(qū)動型qPCR儀選型攻略-6

       伯樂MyiQ實時PCR儀配有一FAM/SYBR Green I熒光檢測通道，具備基因表達、基因拷貝數(shù)、陰陽判定等基礎(chǔ)分析功能。 

       Eppendorf Mastercycler ep realplex 2和伯樂DNA Engine Option 2代表的FAM/SYBR Green I和HEX/TET/VIC雙通道熒光檢測系統(tǒng)，可在一個反應(yīng)孔中同時檢測兩種熒光信號，使基因表達雙重PCR檢測(Duplex)、復(fù)雜SNP基因分型實驗成為可能。但2個通道實時熒光PCR儀，不能檢測620nm波長信號，無法使用TaqMan Universal PCR Master Mix這類含ROX參比熒光染料的試劑，限制了進行更復(fù)雜Multiplex定量分析或諸如LC Red 640一類染料標記TaqMan探針檢測。于是，3通道的QuantiStudio 1和Stepone，4通道的QuantiStudio 3、SteponePlus和Stratagene Mx3000P、5通道的7500 Fast、QuantiStudio 6 Pro和CFX Opus 384等）和6通道的QuantiStudio 5、QuantiStudio 7 Flex、CFX96-Touch和CFX Opus 96等多檢測通道qPCR儀應(yīng)運而生。不僅方便了Triplex、quadraplex、five-target甚至six-target這類多靶標同步定量分析，還為系統(tǒng)兼容FRET雙雜交探針應(yīng)用提供了關(guān)鍵硬件支持。 

       2008年，LightCycler 480 II首開6個熒光檢測通道記錄，伯樂CFX 96、ABI Viia7于2010年前后腳尾隨而至。競爭驅(qū)動下，實時熒光定量PCR儀新一輪擴充熒光通道數(shù)量的革命快要來了嗎？

一、qPCR儀熒光信號采集流程的分析 

       實時熒光數(shù)據(jù)采集（Data Collection or Plate Read）時間點因?qū)嶒烆愋投袇^(qū)別。對于定量分析實驗，無論是SYBR Green I染料，還是熒光染料標水解探針、FRET雙雜交探針，通常是在PCR延伸步驟進行數(shù)據(jù)收集。 

       PCR退火溫度是指體系中50%引物處于與模板結(jié)合狀態(tài)時的溫度。這一常識告訴我們，反應(yīng)孔內(nèi)引物、探針與模板片段的特異性結(jié)合并非頃刻間同步完成的，而是有一個持續(xù)數(shù)秒鐘時間的過程。故熒光數(shù)據(jù)采集是個動態(tài)過程，系統(tǒng)自動生成多個時間點，最終將多個時間點采集數(shù)據(jù)均值代表本循環(huán)熒光數(shù)據(jù)并存儲。 

       安捷倫Mx3000P qPCR系統(tǒng)中，用戶通過軟件的“高級算法設(shè)置”選項可對每個循環(huán)中熒光數(shù)據(jù)采樣次數(shù)設(shè)置（設(shè)定范圍1-31，默認為3次）。系統(tǒng)自動計算完成指定數(shù)量采樣所需的總讀板時間、決定每一論循環(huán)的首個數(shù)據(jù)采集啟動時間。如，間隔7秒鐘采樣一次，每個循環(huán)收集數(shù)據(jù)3次，則系統(tǒng)將在每一循環(huán)的延伸步驟倒數(shù)第21秒這個時間點啟動熒光數(shù)據(jù)采集（For example, if reading a plate takes 7 seconds and the specified number of data collection points is 3, the system will begin collecting data when 21 seconds remain in the plateau or ramp.）。如延伸步驟時間設(shè)定低于21秒，系統(tǒng)將提示時間設(shè)置無效。 

       默認情況下，ABI PRISM 7700 Sequence Detection System每隔7秒中在PCR循環(huán)的延伸階段進行一次熒光信號采集。CCD每次曝光持續(xù)時間25毫秒（可設(shè)定范圍為5-255毫秒）。增加曝光時間可增加熒光信噪比，有助于提高檢測性能。但延長曝光時間會產(chǎn)生2個不良后果：一是增加可能引發(fā)CCD過飽和，二是增加單次曝光時間后，特定PCR延伸時長內(nèi)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集次數(shù)須減少（fewer data points are collected in a given extension time），而這將影響檢測結(jié)果的準確性。若想要維持數(shù)據(jù)收集次數(shù)，則必須增加延伸保持時間。 

       資料表明，ABI PRISM 7700和Viia7系統(tǒng)軟件內(nèi)置算法會在PCR循環(huán)的延伸步驟后半段采集的3個數(shù)據(jù)的平均值來代表此循環(huán)的熒光數(shù)據(jù)信號強度值。延伸的時間至少為30秒，以確保延伸步驟期限完成數(shù)據(jù)采集操作（For best results, the extension step should be at least 30 seconds to allow collection of sufficient data.） 

       7700系統(tǒng)將這一步時間設(shè)定為60s，目的是在首次熒光數(shù)據(jù)采集前留出39s時間，達到常規(guī)三溫度循環(huán)中退火所需30s時長，確保雙鏈延伸得有效啟動和持續(xù)一定時間。由于常規(guī)三步溫度循環(huán)法擴增流程中，72℃延伸步驟時間通常不超過30s，不符合7700系統(tǒng)熒光數(shù)據(jù)采樣設(shè)計要求。

       因此，眾多實時熒光定量PCR試劑使用指南通常會提示，擴增時應(yīng)根據(jù)所用儀器型號來設(shè)定延伸步驟的時長。如規(guī)定Roche、Bio-Rad和Agilent的qPCR儀的延伸時間不低于15s，ABI 7000/7300時間至少為31秒。 

       《實時熒光定量PCR反應(yīng)雙溫循環(huán)法的合理性及局限性》討論了qPCR實驗擴增的雙溫循環(huán)法。人們?yōu)槌Ｒ?guī)短片段序列專門建立了anneal-extension兩步溫度循環(huán)法。其中一個重要原因就是這樣的退火/延伸合并步驟的時間設(shè)定具有極大靈活性，既有效滿足實驗PCR擴增產(chǎn)量和特異性要求，又打破了傳統(tǒng)三溫度循環(huán)法中常用的延伸步驟中的時間長度不夠的約束，適應(yīng)了熒光信號采集的精準度要求。此后，人們在此基礎(chǔ)上將60s時間壓縮為45s，以縮短qPCR反應(yīng)時長，提供實驗效率。 

二、快速PCR反應(yīng)模式和多色熒光檢測帶來的新挑戰(zhàn) 

       需注意，7秒間隔和60℃最低維持30秒時長僅是標準反應(yīng)速度模式下單色熒光檢測所需反應(yīng)條件。 

       如《PCR升降溫速度在實時熒光定量PCR實驗中的作用與意義-下》所述，若用7500 Fast、QuantiStudio 3/5/6/7、StepOnePlus系統(tǒng)的快速PCR模式，則擴增循環(huán)各步驟持續(xù)時間大幅縮短，延伸時長不過10-15s。系統(tǒng)須啟用Fast模式實施熒光數(shù)據(jù)采集，即每個循環(huán)采集次數(shù)不變而縮短采樣時間間隔（3秒以內(nèi)），才能完成數(shù)據(jù)的有效采集。 

       若要進行multiplex多色熒光實驗，每次數(shù)據(jù)采集前須進行設(shè)定熒光通道輪換這一必需動作。我們LightCycler 480實時熒光定量PCR儀為例予以說明。

       LightCycler 480的熒光通道包含6個發(fā)射熒光濾鏡，安裝于步進電機驅(qū)動的濾鏡輪中。在multiplex分析中，各熒光檢測通道是一組組依次旋入旋出檢測工位完成相應(yīng)波長熒光數(shù)據(jù)的采集。濾鏡輪單次切換通道時間約0.65秒，這意味著完成5色熒光檢測時，Cyan 500通道信號采集時間點比CY5通道早3.25s，不同檢測通道熒光數(shù)據(jù)的時效性不一。 

       加大濾鏡輪直徑以容納更多濾鏡的研發(fā)成本和進行更多色熒光檢測的必要性拋開不論，但檢測通道數(shù)量增加伴隨的技術(shù)風(fēng)險則應(yīng)引起重視。 

       首先，檢測通道輪換時濾鏡輪需反復(fù)啟動、剎車，產(chǎn)生檢測時間遲滯。檢測通道越多，機械運動延遲也增多，完成全部熒光通道切換所需時間必然增加。 

       其次，也是最關(guān)鍵的，就是熒光通道越多，會造成不同熒光探針標記樣品的信號采集時間差距被放大。LightCycler 480系統(tǒng)這一時差將由目前的3.9秒飆升至4秒以上。其結(jié)果是，同一反應(yīng)孔，靶標1檢測時間比靶標5時間提前了4秒，意味著靶標1的延伸時間比靶標5足足少了4秒鐘。延伸反應(yīng)時長的差別，勢必造成靶標1擴增產(chǎn)物量的在采樣點存在輕微差異，從而出現(xiàn)熒光通道測試值“后發(fā)優(yōu)勢”偏差現(xiàn)象。 

       其次是，在每輪數(shù)據(jù)采集時間期限內(nèi)，CCD數(shù)據(jù)采集可用時長被壓縮。檢測通道達到10個以上時，系統(tǒng)須將延伸步驟的首次數(shù)據(jù)采集時間點提前，或整體延長延伸階時間，方可有效完成數(shù)據(jù)采集，這必將使每輪熒光數(shù)據(jù)檢測值隨之改變。 

       伯樂CFX系列實時熒光定量PCR儀光學(xué)檢測系統(tǒng)為光梭式（optics shuttle）結(jié)構(gòu)設(shè)計。光梭移動呈“弓”字形軌跡，從A1 →A12 →B12 →B2 →C3 →C12……直至H12完成整板信號采集。采集某一種熒光信號時，步進馬達驅(qū)動特定檢測光路移動到被檢測反應(yīng)孔正上方并精確對準反應(yīng)孔后再啟動熒光的激發(fā)和信號采集，隨后移出工位。

       資料顯示，CFX Opus 96、CFX 96-touch實時熒光定量PCR儀96孔板完成FAM通道掃描耗時3s，完成5色熒光采集所需最短時間為12s（考慮通道切換的時間遲滯，實際時長大于12s）。這表明：CH1通道(FAM)與CH5通道(Quasar 705/Cy5.5)的熒光信號采集時間存在高度異步現(xiàn)象，采樣點時差達12s之多。本應(yīng)與第1個靶標同步數(shù)據(jù)采集的第5靶標，額外增加了12s延伸反應(yīng)時間。這必然改變采用不同熒光標記靶標間熒光數(shù)據(jù)的真實、等效對比。

       Multiplex分析所用熒光檢測通道越多，不同靶標熒光數(shù)據(jù)采集時間差距越大，檢測數(shù)據(jù)組間結(jié)果對比的失真現(xiàn)象越嚴重。 

表1 Optical Detection Performance Specifications of CFX Opus system 

       因此，目前普遍采用的qPCR光學(xué)模塊結(jié)構(gòu)設(shè)計，已對進一步增加檢測通道的數(shù)量構(gòu)成制約。 

       除非qPCR借鑒流式細胞儀的固定光路系統(tǒng)和空間立體激發(fā)技術(shù)。否則，進一步增加熒光檢測通道不僅面臨研發(fā)成本難題，更重要的是會直接危害Multiplex等多色熒光檢測實驗數(shù)據(jù)的可靠性、可信性。  

參考文獻

［1］MxPro QPCR Software Instruction Manual for Mx3000P and Mx3005P QPCR Systems(Software version 4.10)
［2］ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User′s Manual(904989B,01/2001)
［3］LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5
［4］CFX Opus 96 and CFX Opus 384 Real-Time PCR Systems Instrument Guide