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瞬息涼炎代謝頻——動物能量代謝分析系統(tǒng)實驗應用問題的討論
一、間接量熱法動物能量代謝分析系統(tǒng)實驗應用發(fā)文情況
19世紀上半葉，俄國化學家赫斯（G.H. Hess）從熱化學研究中得出能量轉化與守恒定律（(law of constant heat sums，即熱力學第一定律）：同一種化學反應中熱和功的總量，只取決于反應體系的始、末狀態(tài)，與反應的途徑無關。
動物的生命是由催化燃燒驅動的一種復雜的“生命之火”。根據(jù)Hess定律，低溫生物“火”所釋放的熱量與在彈式量熱儀（bomb calorimeter）中高溫劇烈燃燒等量食物產生的熱量相同。就是說，一般化學反應的基本規(guī)律，同樣適用于人動物體內營養(yǎng)物質氧化供能的反應。譬如，在動物體內氧化1 mol葡萄糖，同在體外氧化燃燒1mol葡萄糖一樣，都是要消耗6 mol O2、同時產生6 mol CO2和6 mol H2O，而且產生的熱量也相等。因此，測定一定時間內機體所消耗的食物，或檢測機體所產生的熱量與所做的外功，即可測算出機體單位時間內所消耗的能量（energy expenditure/EE，能量代謝率）。
故測定機體代謝釋放的熱量可有直接量熱法和間接量熱法兩種技術途徑。
直接量熱法（direct calorimetry, DC）是測定在特定時間內整個機體向外界釋放的總熱量，其中包括在測定期間機體對外所做的機械功（折算為熱量值后一并計入總熱值）。該方法雖然最直接準確，但所需技術設備、實驗條件復雜，難以實現(xiàn)批量規(guī)模化操作。
間接量熱法（indirect calorimetry，IC）的理論依據(jù)是能量守恒和物質守恒兩大定律：能量代謝的初始底物、最終代謝產物相同，則代謝產生的熱量相同，反應消耗的底物（如1 mol葡萄糖）、所需氧氣（6 mol O2）、最終氧化產物（6 mol CO2和6 mol H2O）相同，底物與產物存在定比。間接量熱法無須直接檢測機體所釋放的熱量，而是通過測定釋熱反應所消耗O2量、反應終產物CO2（和/或H2O）的產量，結合蛋白質的消耗比例，通過Weir公式即可計算出代謝過程產生的總熱量。
間接量熱法測試簡便易行，只需高精度氣體傳感器和小型化簡單艙室即可完成，技術路線成熟且具有高通量優(yōu)勢。IC不僅特別適合動物實驗采用，也被應用于人體代謝監(jiān)測。德國TSE公司PhenoMaster NG Metabolic and Behavioral Phenotyping System（代謝與行為表型系統(tǒng)）、美國Sable公司Promethion Core Behavioral and Metabolic Phenotyping Systems及美國Columbus公司Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS，綜合實驗動物監(jiān)測系統(tǒng))都屬基于IC原理的小動物能量代謝監(jiān)測系統(tǒng)。
依托這些測試平臺開展實驗的報道，最早見于2009年馬普衰老生物學研究所&科隆大學Jens C. Brüning研究團隊關于中樞神經(jīng)系統(tǒng)TLR-4/MyD88信號傳導通路對飲食誘導肥胖調控機制研究的論文。國內山東大學附屬山東省立醫(yī)院（Sci Rep. 2016）、中國農業(yè)大學動物科技學院（J Anim Sci. 2018）較早開展了這方面的動物實驗研究，且已有公開成果發(fā)表。
(PubMed期刊數(shù)據(jù)庫檢索時間2023-01-03。查詢關鍵詞為：PhenoMaster[Text Word] AND TSE[Text Word]、Promethion [Text Word] AND Sable[Text Word]、Promethion[Text Word] AND SSI[Text Word]、Oxymax CLAMS[Text Word] AND Columbus[Text Word]；PubDate：～2022-12-31)
數(shù)據(jù)顯示， 2015年以來，間接量熱法能量代謝分析系統(tǒng)應用的實驗發(fā)文開始呈快速增長勢頭。2020-2022三年間，IFoid打分5分以上期刊有關發(fā)文總數(shù)為448篇。僅2022年，IFoid分大于10.0期刊發(fā)表的上述品牌動物能量代謝分析系統(tǒng)有關的實驗論文55篇。
表1 TSE、Sable和Columbus品牌動物能量代謝分析系統(tǒng)2022年高分刊文列舉
序號 | 刊文年份(Pub Date) | 發(fā)文期刊名稱縮寫 | 有關刊文數(shù)量 | 刊物IFoid |
1 | 2022 | Nat Med | 1 | 87.2448 |
2 | 2022 | Nature | 2 | 69.5026 |
3 | 2022 | Cancer Discov | 1 | 38.2728 |
4 | 2022 | Natl Sci Rev | 1 | 23.1784 |
5 | 2022 | Nat Metab | 4 | 19.8893 |
6 | 2022 | Nat Commun | 19 | 17.6939 |
7 | 2022 | J Exp Med | 2 | 17.5780 |
8 | 2022 | Adv Sci (Weinh) | 1 | 17.5213 |
9 | 2022 | Cell Rep Med | 1 | 16.9885 |
10 | 2022 | Microbiome | 2 | 16.8363 |
11 | 2022 | Alzheimers Dement (N Y) | 1 | 16.6556 |
12 | 2022 | Sci Adv | 7 | 14.9797 |
13 | 2022 | Acta Pharm Sin B | 1 | 14.9069 |
14 | 2022 | Cardiovasc Res | 1 | 14.2394 |
15 | 2022 | Proc Natl Acad Sci U S A | 1 | 12.7784 |
16 | 2022 | Exp Mol Med | 1 | 12.1718 |
17 | 2022 | J Cachexia Sarcopenia Muscle | 2 | 12.0626 |
18 | 2022 | Theranostics | 2 | 11.6000 |
19 | 2022 | eBioMedicine | 1 | 11.2048 |
20 | 2022 | Aging Cell | 1 | 11.0047 |
21 | 2022 | Int J Biol Sci | 1 | 10.7500 |
22 | 2022 | Diabetologia | 1 | 10.4604 |
23 | 2022 | Mol Ther Nucleic Acids | 1 | 10.1830 |
(注：IFoid數(shù)據(jù)引自https://sci.justscience.cn)
這55個采用能量代謝分析系統(tǒng)測試數(shù)據(jù)實驗研究項目，大致可歸入系統(tǒng)代謝調控、脂肪產熱機制、脂肪代謝疾病等8個方向。其中，米色脂肪（beige adipose tissue）的生成(Qiang Wang, et al. Nature. 2022；609(7925))和代謝產熱（thermogenesis）(Birte Niemann, et al. Nature. 2022；609(7926))、肥胖癥是研究熱點。
整體能量代謝調控機制研究則涉及多個維度，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)（如生物鐘、伏隔核）異常、內分泌異常（如甲狀腺功能減退）、代謝相關基因突變（如COX7a2L基因變異）、寒冷暴露、糖皮質激素藥物等臨床藥物代謝副作用等。
二、動物能量代謝分析系統(tǒng)核心測試指標
機體依靠呼吸功能從外界吸入02供組織細胞營養(yǎng)物質氧化分解，為生命活動提供能量，同時將代謝終產物C02和H20呼出體外。特定時間內，機體能量代謝的二氧化碳產量(carbon dioxide production, VC02)與耗氧量(oxygen consumption, VO2)的比值VC02/V02，命名為呼吸熵（Respiratory Quotient, RQ）。
糖、脂肪和蛋白質，由于C、H、O三種元素組成比例不同，完全氧化所產生的C02、H20與消耗的02耗氧量存在巨大差異，RQ值因而各不相同。
碳水化合物分子中碳和氧的比例相等，氧化時消耗的02與產生C02分子數(shù)相等。以葡萄糖為例：C6H12O6 + 6 02 → 6 C02 + 6 H2O，故RQ (glucose) = 6 C02/6 02 = 1。
脂肪分子中的氧對碳、氫原子的比例比糖少，故要消耗更多外部提供的氧氣。
以三油酸甘油酯(triolein)為例：C57H104O6 + 80 02 → 57 C02 + 52 H2O，RQ (triolein) = 57 C02/80 02 = 0.71。
再如三棕櫚酸甘油酯(Tripalmitin)的氧化：2 (C51H98O6) + 145 02 → 102 C02 + 98 H2O，RQ (tripalmitin) = 102 C02/145 02 = 0.7。
蛋白質的氧化分解產熱是根據(jù)碳和氫的組成比例計算得到的，RQ理論值為0.80。
根據(jù)呼吸氣體交換數(shù)據(jù)VC02、V02，計算出RQ值，代入Weir公示即可獲得代謝能量消耗(energy expenditure, EE)值。
公式中：EE單位為kcal/h，V02單位為L/h，P是蛋白質代謝產能貢獻占總EE的比例（一般情況下，健康機體活動所需熱量供應主要源于糖水化合物和少量儲備脂肪氧化，蛋白質的氧化供能所占比例近乎于0），V02及VC02均為按標準溫度/大氣壓/濕度（standard temperature and pressure, dry, STPD)歸一化的校正值。
有了V02、VC02，就可實現(xiàn)EE的精確定量。
小動物能量代謝分析系統(tǒng)的代謝測試指標中，常用氣體交換比率(Respiratory exchange ratio, RER)指代RQ，以Heat表示EE。
［02 concentration］：指輸入測試籠(box or cage)的空氣的02分壓，它與輸入對照空測試籠（reference）氣流02氧分壓（incurrent fractional oxygen, Fi02）完全對等；
［dC02］：指從測試籠抽取的經(jīng)動物呼吸后，輸出氣流O2氧分壓（excurrent fractional oxygen, Fe02）與對照籠輸入氣流的氧分壓之差（FiO2 minus Fe02，即ΔF02）實測值；
［V02］：指［dC02］轉換為以mL/h為單位的計算值；
［Flow］、［Temp］：分別指輸入測試籠或從籠中抽吸氣流的流速和籠內實時溫度。系統(tǒng)自動將測試氣流中采樣氣體體積進行STPD歸一化處理。
測試籠氣流流速越大，動物呼吸交換后的C02、02在籠內作無序對流、擴散和積聚越少，可更有效地被“沖刷”帶出籠外，越有利于消除、降低呼吸交換氣流與測試采樣氣流之間的滯后效應，避免因C02濃度在籠內局部的積聚、擴散影響靜息代謝率（resting energy expenditure, REE.是指機體禁食2h以上并在合適溫度下平靜/臥休息后的靜息能量消耗）、活動代謝率（AEE）指標測試準確性，越易于實現(xiàn)實時監(jiān)測、多指標間同步效果。因此，業(yè)界對間接量熱法代謝氣體分析測試有統(tǒng)一標準：氣流流速需滿足1小時內實現(xiàn)4輪測試籠內氣體完全更新的要求。有一專用詞匯叫籠時間常數(shù)（cage time constant），是指測試籠內氣體全部更新一遍所需的時間。它由籠內有效氣體容積、工作氣體流速決定。常數(shù)值小換氣速度快。
氣流流速應針對不同測試籠內部容積、有效空間差異進行必要優(yōu)化，以確保達標。資料顯示，Sable Promethion Core系統(tǒng)可實現(xiàn)最高2000ml/min的氣體流速。
不同測試系統(tǒng)的測試過程中數(shù)據(jù)模塊采集界面、數(shù)據(jù)分析模塊工作界面，所顯示的指標略有差異，但后臺控制系統(tǒng)執(zhí)行的采樣參數(shù)基本一致。
TSE PhenoMaster NG系統(tǒng)的PhenoMaster Software程序界面，V02、RER分別以藍色、綠色曲線呈現(xiàn)。
從Columbus的Oxymax CLAMS系統(tǒng)的實驗設置界面可以看出，系統(tǒng)顯示代謝參數(shù)包含了02IN（即Fi02），02OUT（即Fe02），D02，V02，C02IN，C02OUT，DC02，VC02，RER、Heat，F(xiàn)low這一系列核心功能指數(shù)。此外，還提供了ACC02（02累計消耗量）、ACCC02（C02累計消耗量）兩項指標。
Sable Promethion Core系統(tǒng)代謝模塊實時自動采集每個測試動物的V02、VC02原始數(shù)據(jù)，計算RQ并實時顯示EE動態(tài)曲線。實驗者可通過系統(tǒng)的電腦工作站本地方式，或通過IM3軟件模塊從移動設備等遠程模式，實時操作和堅持、分析V02、VC02、RQ和EE數(shù)據(jù)。
三、動物能量代謝分析系統(tǒng)的常規(guī)應用類型
3.1 動物能量代謝狀態(tài)的監(jiān)測
通過監(jiān)測的V02、VC02和EE數(shù)據(jù)結合動物活動水平數(shù)據(jù)，可以直觀地比較不同實驗干預分組動物的能量代謝水平。
如一項由Beth Israel Deaconess醫(yī)療中心&哈佛醫(yī)學院、西安交通大學共同完成的關于PR結構域蛋白16 (PR domain-containing 16, PRDM16)穩(wěn)定性對米色脂肪產生（beige fat biogenesis）的影響及機制研究證實，cullin-RING家族成員CUL2在脂肪細胞中的過表達CUL2時，可降低PRDM16蛋白的穩(wěn)定性。CUL2-APPBP2作為泛素 E3 連接酶，催化PRDM16多泛素化。脂肪組織中CUL2–APPBP2表達升高，通過降解PRDM16蛋白而抑制脂肪細胞產熱。而抑制CUL2–APPBP2則可延長PRDM16蛋白的半衰期，并促進了米色脂肪產生。CUL2、Appbp2基因敲除小鼠均可出現(xiàn)PRDM16的多泛素化水平降低，顯著延長PRDM16的半衰期。對脂肪特異性Appbp2-KO小鼠（Adipo-Appbp2-KO）敲除小鼠的代謝表型分析顯示：在正常飲食下，與對照組相比，Adipo-Appbp2-KO小鼠的V02增加、呼吸交換比（VC02 / V02）降低，但未出現(xiàn)體重差異，且表現(xiàn)出適度的高耐寒性。說明在高脂喂養(yǎng)后，基因敲除小鼠的能量消耗顯著高于對照組。因此，研究證實PRDM16蛋白穩(wěn)定可實現(xiàn)代謝健康狀態(tài)的改善、UCP1介導的米色脂肪產熱。
3.2 動物能量代謝底物的分析
機體的RQ值由特定時間內主要能量代謝組份決定。一般情況下，能量來源主要是碳水化合物，RQ=1.00。若動物采用高脂喂食(high-fat diet，HFD)實驗，或正常喂食模式下運動時間過長（如長跑）、劇烈運動或諸如冷挑戰(zhàn)實驗（cold-challenge experiments）這類高熱量消耗，需動用儲備脂肪產熱的條件下，則RQ值低至0.71 - 0.80之間。在長期饑餓情況下，動物體內的碳水化合物與脂肪耗竭，或進行實驗動物長期高蛋白膳食(high protein diet，HPD)實驗，機體的能量主要來自蛋白質的分解，則RQ≈0.80。
因此，根據(jù)RQ值可分析特定時間動物機體代謝產生能量所消耗的底物種類。
測量RQ值可以反映特殊疾病模型、特殊用藥群體的營養(yǎng)狀態(tài)。如糖尿病模型、肌營養(yǎng)不良癥、脂肪營養(yǎng)不良綜合征、腫瘤惡病質等，因體內脂肪消耗而往往呈現(xiàn)RQ的降低。RQ值回升到0.81 - 1.00，提示營養(yǎng)改善后機體能量代謝逐步恢復。
參考文獻
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［2］Qiang Wang, Huixia Li, Kazuki Tajima, et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 2022; 609(7925): 151–158.
［3］Janane F. Rahbani, Charlotte Scholtes, Damien M. Lagarde, et al. ADRA1A–Gαq signalling potentiates adipocyte thermogenesis through CKB and TNAP. Nat Metab. 2022; 4(11): 1459–1473.
［4］Birte Niemann, Saskia Haufs-Brusberg, Laura Puetz, et al. Apoptotic brown adipocytes enhance energy expenditure via extracellular inosine. Nature. 2022; 609(7926): 361–368.
［5］Rafal Czapiewski, Dzmitry G. Batrakou, Jose I. de las Heras, et al. Genomic loci mispositioning in Tmem120a knockout mice yields latent lipodystrophy. Nat Commun. 2022; 13: 321.
