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雷霆收罷江海凝 —— 試析近垂直轉(zhuǎn)子在超速離心中的應(yīng)用-下
（續(xù)：試析近垂直轉(zhuǎn)子在超速離心中的應(yīng)用-中）
2、超速離心實(shí)驗(yàn)中NVT轉(zhuǎn)頭的應(yīng)用價值
全球有Beckman、日立Himac（已并入德國eppendorf）和賽默飛Sorvall三大超離制造商。受限于技術(shù)小組人力和時間，我們僅選擇了Beckman落地式超速離心機(jī)的近垂直轉(zhuǎn)頭作為考察目標(biāo)。
基于調(diào)研結(jié)果，我們來討論本文開頭提出的問題：NVT轉(zhuǎn)頭的性能優(yōu)勢、開發(fā)與使用NVT的特殊意義。
2.1 NVT轉(zhuǎn)頭應(yīng)用的獨(dú)特技術(shù)優(yōu)勢
超速離心時，溶液中的生物組分粒和蔗糖、CsCl等梯度介質(zhì)分子在相當(dāng)于105～106倍重力加速度強(qiáng)度的離心場中克服阻力水平離心方向遷移（沉降）。一定時間后，自動形成內(nèi)側(cè)低、外側(cè)高的介質(zhì)濃度分化（溶液密度）分布格局。各種被分離組分則依自身沉降速度或密度不同，在介質(zhì)相應(yīng)濃度區(qū)帶中聚集，形成多條相互間隔一定距離、可視化的絮狀條帶。
上圖形象地描繪了樣品、梯度介質(zhì)溶液層在超速離心過程中液體層從變形、分層再重新定位的演變過程。這足以說明，密度梯度離心分離過程，主要是由超強(qiáng)的離心場和相對微弱的重力場這兩種機(jī)制共同作用下促成的。而維持梯度介質(zhì)溶液的密度由內(nèi)向外逐漸走高分布的是離心場。
不同密度帶在管底處產(chǎn)生的液體壓強(qiáng)不同：靠外側(cè)密度相對較高的液柱壓強(qiáng)大。當(dāng)離心力減弱到一定程度后，在重力場作用下，最外側(cè)液體密度帶，向內(nèi)推擠靠內(nèi)側(cè)較低密度的液層使之向內(nèi)、橫向偏移而偏離豎直狀態(tài)?？客鈧?cè)高密度條帶則順勢進(jìn)駐密度較低條帶原先占據(jù)的空間并持續(xù)擴(kuò)張。不同密度條帶因底部發(fā)生向心性擺動，使得在超速運(yùn)行時呈現(xiàn)規(guī)整豎直狀態(tài)的各密度液體層因此而出現(xiàn)傾斜變形、條帶高度的降低。最終在持續(xù)的離心力衰減和重力雙重作用下，各密度層內(nèi)液體由豎改平、管內(nèi)液體密度呈現(xiàn)上層低、底部高、垂直排列的穩(wěn)定格局。相應(yīng)地，被裹挾在各密度層內(nèi)的樣品條帶，體位也隨之出現(xiàn)了90°旋轉(zhuǎn)。
在不發(fā)生劇烈振蕩造成液層重混失誤情況下（為避免離心結(jié)束轉(zhuǎn)頭剎車過程中發(fā)生已分離樣品條帶重混的風(fēng)險(xiǎn)，可采用優(yōu)化Optima XE-90、Optima XPN-90超速離心機(jī)的減速速率設(shè)置，使轉(zhuǎn)頭盡可能平緩地減速），完成旋轉(zhuǎn)并重新定位的液體，因底面積變小，各密度液層厚度都將增加，分布于各密度層內(nèi)的被分離目標(biāo)條帶自身?xiàng)l帶厚度增加的同時，相鄰條帶的間距也隨之增大。離心管長度越長，條帶間距的拉伸效果越顯著。。
轉(zhuǎn)頭在設(shè)定轉(zhuǎn)速下運(yùn)行時，兩組相鄰條帶的間距為d1，轉(zhuǎn)頭剎車后二者間距為d2，設(shè)定NVT轉(zhuǎn)頭管-軸夾角θ，則d2 = d1/cosθ。顯然，d2 ＞ d1。當(dāng)將樣品管取出靜置時，隨著液層底面積縮窄，液層厚度更厚，相鄰條帶間距會在d2基礎(chǔ)上進(jìn)一步加大，故d3 ＞ d2。
NVT轉(zhuǎn)頭與垂直管轉(zhuǎn)頭、定角轉(zhuǎn)頭相同之處在于樣品沉降距離短，有效分離所需時間短。NVT轉(zhuǎn)頭有一定傾角，樣品中組成成份接近或沉降系數(shù)（sedimentation coefficient）相近的條帶在分離結(jié)束、離心管取出后，條帶相互間距加大，利于逐個條帶收集操作，減少操作失誤和污染。這一點(diǎn)比使用垂直轉(zhuǎn)頭時更便利。而相對于傾斜角度高達(dá)20°-45°的定角轉(zhuǎn)頭， NVT轉(zhuǎn)頭的沉降距離更短，分離所需時間縮短、效率提高。
從這一角度看，NVT轉(zhuǎn)頭沉降距離適中、分離后的條帶間距大，既保證離心效率，又兼顧對樣品中密度相近組分的分離質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)了效率和分辨率的統(tǒng)一。
2.2 NVT轉(zhuǎn)頭應(yīng)用的獨(dú)特效率優(yōu)勢
上個世紀(jì)80年代開始，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)迅猛發(fā)展，對核酸純化需求極其強(qiáng)勁。在NVT轉(zhuǎn)頭投產(chǎn)前，菌體質(zhì)粒DNA或基因組的分離純化常用甩平轉(zhuǎn)頭進(jìn)行。CsCl初始密度1.71g/cm3在20℃條件下33000rpm離心，可獲得高純度DNA，但每輪離心耗時超過70個小時，效率極低。
超速離心機(jī)制造商推出NVT轉(zhuǎn)頭的初衷，正是用于取代常用的水平轉(zhuǎn)頭以實(shí)現(xiàn)快速CsCl梯度離心純化質(zhì)粒/DNA等樣品。若改用NVT轉(zhuǎn)頭，加入EB和Triton x-100后使CsCl梯度溶液上樣密度降低至1.55g/cm3，用78000rpm、20℃條件下完成相同樣品離心，任務(wù)時間可縮短至4小時。
為何高轉(zhuǎn)速的NVT轉(zhuǎn)頭離心可以節(jié)省離心時間？
超速離心達(dá)到一定時間后，密度梯度介質(zhì)形成近軸端濃度低而遠(yuǎn)端濃度高的溶液濃度梯度（密度梯度）布局，即“自成梯度”現(xiàn)象。如上樣時初始密度1.55g/cm3的CsCl溶液，最終形成了從近-遠(yuǎn)方向0.84–1.72g/cm3的新密度分布態(tài)勢。
一般來說，相同溫度條件下，梯度介質(zhì)密度增加，不僅是溶液對樣品顆粒的浮力阻力增加，溶液的粘度也會隨之升高，故樣品組分遷移時所受的摩擦阻力也增加。當(dāng)樣品所受正向離心力與介質(zhì)溶液施加的反向阻力達(dá)到平衡后，原本緩慢沉降的樣品迅速減速并最終停滯在特定位置、特定密度介質(zhì)層中。收集處于不同位置的樣品條帶，通過折射儀檢測后，即可獲得該組分在特定實(shí)驗(yàn)離心條件下的浮力密度值。
可見，樣品的浮力密度值與特定實(shí)驗(yàn)所用的轉(zhuǎn)頭性能屬性、溫度條件、工作轉(zhuǎn)速、梯度介質(zhì)類型與濃度均有關(guān)系。同種樣品組分，實(shí)驗(yàn)條件不同，則測得的浮力密度數(shù)據(jù)，只可能比較接近，但難以完全一致。而正式超速離心實(shí)驗(yàn)刊文，一般無須提供樣品的浮力密度數(shù)據(jù)。實(shí)際工作中，人們可參考前人提供的待分離樣品組分浮力密度測試值，設(shè)計(jì)和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所需的梯度介質(zhì)類型、介質(zhì)溶液初始上樣濃度，選擇介質(zhì)的不連續(xù)階梯密度或連續(xù)密度梯度的分離方案。
樣品組分的浮力密度值與樣品的沉降系數(shù)、在特定和梯度介質(zhì)溶液中的遷移距離、有效分離所需時間的長短有直接關(guān)系。
上文列舉的質(zhì)粒DNA CsCl梯度離心，屬自形成連續(xù)密度梯度離心（continuous density gradient centrifugation）或平衡等密度離心。自形成梯度密度離心時間的計(jì)算公式為：
公式中： N為離心實(shí)際工作轉(zhuǎn)速（rpm）； ρP 為離心后樣品條帶所處位置離心介質(zhì)的密度（代表該樣品組分的浮力密度）；ｒp 為樣品條帶所處位置的離心半徑值（從旋轉(zhuǎn)軸心沉降到等密度帶的距離）；β0為梯度介質(zhì)的密度梯度比例常數(shù)；S20.W代表樣品組分在20℃純水中的沉降系數(shù)。
該公式表明：
1）采用同一轉(zhuǎn)頭離心時，提高工作轉(zhuǎn)速，將節(jié)省離心時間。
隨著轉(zhuǎn)速提高，梯度介質(zhì)生成的密度-離心半徑構(gòu)建的曲線斜率增加。越接近離心管底部（外側(cè)），密度曲線的斜率越大。而密度梯度曲線變陡，則不僅使單一組分聚集形成的條帶縮窄，而且不同浮力密度組分所生成的各條帶之間分布更密集。
而基于前面NVT轉(zhuǎn)頭技術(shù)優(yōu)勢的討論意見， 當(dāng)相鄰組分條帶的間距相近時，NVT轉(zhuǎn)頭要比甩平轉(zhuǎn)頭離心后的條帶收集操作更便利。
2）轉(zhuǎn)速相同，不同轉(zhuǎn)頭離心半徑不一，其梯度介質(zhì)密度梯度曲線大相徑庭，造成同種樣品組分條帶的分布位置存在差異。
如圖所示，甩平轉(zhuǎn)頭的ｒp顯然大于角轉(zhuǎn)頭和NVT轉(zhuǎn)頭。從NVT 90轉(zhuǎn)頭和SW60 Ti兩款轉(zhuǎn)頭60000rpm轉(zhuǎn)速、20℃溫度、相同初始濃度CsCl溶液離心相同時間后所形成的自成梯度曲線圖中可以看出，ρP=1.60g/mL梯度條帶對應(yīng)的ｒp，NVT 90轉(zhuǎn)頭中為57.1mm，而SW60 Ti轉(zhuǎn)頭為112.7mm，其差異之懸殊顯而易見。
3）相同樣品組分、溫度、初始梯度介質(zhì)溶液和轉(zhuǎn)速情況下，樣品組分實(shí)際ρP值有出入，但十分接近。故兩種離心環(huán)境下ρP-1值接近。但ｒp則不同：樣品條帶所處位置ｒp中，甩平轉(zhuǎn)頭的ｒp比NVT轉(zhuǎn)頭的ｒp值大得多。
根據(jù)公式計(jì)算結(jié)果是：樣品在NVT轉(zhuǎn)頭完成分離所需離心時間將明顯少于甩平轉(zhuǎn)頭的用時；若在NVT轉(zhuǎn)頭上采用更高轉(zhuǎn)速，則離心時間還有進(jìn)一步壓縮的空間。
2.3 轉(zhuǎn)頭離心效率的簡單評估方法
先看一下Beckman 超速離心機(jī)NVT、SW轉(zhuǎn)頭工作性能比較表。
轉(zhuǎn)頭的k-Factor（k因子）可簡單地概括為：
1）K數(shù)值越小，則轉(zhuǎn)頭分離效率越高；
2）它對應(yīng)于轉(zhuǎn)頭的Rmax/Rmin比值、轉(zhuǎn)頭最高工作轉(zhuǎn)速；
3）運(yùn)行轉(zhuǎn)速降低和最大有效離心半徑減小，K因子數(shù)值會升高。表2列出了各轉(zhuǎn)頭在不同轉(zhuǎn)速條件下K數(shù)值的變化。
對使用者而言，K因子的價值在于可用于衡量轉(zhuǎn)頭離心效能和離心時間的簡單評估。
在樣品、離心介質(zhì)溶液和溫度都一致情況下，有效離心時間與K因子成正比，與樣品組分沉降系數(shù)成反比。
用公式可表示為：
T=K/S
基于沉降系數(shù)與樣品浮力密度密切相關(guān)，采用不同轉(zhuǎn)頭時測定的沉降系數(shù)略有出入。因此，公式可以用于樣品有效離心時間長短的簡單粗略評估時參考。這一點(diǎn)，無論Beckman Microfuge 16臺式微量高速離心機(jī)、Allegra X-30R臺式冷凍離心機(jī)、Avanti JXN-26 和Avanti J-26S XP立式大容量低溫高速離心機(jī)，還是Optima XE-90、Optima XPN-80和Optima XPN-100超速離心機(jī)都適用。
表2. Beckman 超速離心機(jī)NVT、SW轉(zhuǎn)頭工作性能比較表
Rotor Capacity | Speed | RCF max RCF av RCF min | R max R av R min | k-factor | Rotor Capacity | Speed
| RCF max RCF av RCF min | R max R av R min | k-factor |
SW 60 Ti (6×4 mL) | 60000 rpm | 484289 ×g | 120.3 mm | 45.0 | NVT 100 (8×5.1 mL) | 100000 rpm 80371 rpm 75680 rpm | 749223 ×g 484289 ×g 369155 ×g | 67.0m m 57.6 mm 48.3 mm | 8.0 |
12.4 | |||||||||
369155 ×g | 91.7 mm | 14.0 | |||||||
NVT 90 (8×5.1 mL) | 90000 rpm 78019 rpm 73063 rpm | 645000 ×g 484289 ×g 369155 ×g | 71.1 mm 61.8 mm 52.4 mm | 10.0 | |||||
254020 ×g | 63.1 mm | 13.3 | |||||||
15.2 | |||||||||
SW 55 Ti (6×5 mL) | 55000 rpm | 367022 ×g | 108.5 mm | 48.0 | NVT 100 (8×5.1 mL) | 100000 rpm 66633 rpm 69967 rpm | 749223 ×g 286175 ×g 367022 ×g | 67.0 mm 57.6 mm 48.3 mm | 8.0 |
18.0 | |||||||||
16.3 | |||||||||
286175× g | 84.6 mm | NVT 90 (8×5.1 mL) | 90000 rpm 64329 rpm 67920 rpm | 645000 ×g 286175 ×g 367022 ×g | 71.1 mm 61.8 mm 52.4 mm | 10.0 | |||
19.6 | |||||||||
17.6 | |||||||||
205667 ×g | 60.8 mm | NVT 65.2 (16×5.1 mL) | 65000 rpm 57114r pm 60185 rpm | 416000 ×g 286175 ×g 367022 ×g | 87.9 mm 78.4 mm 68.8 mm | 15.0 | |||
19.4 | |||||||||
17.5 | |||||||||
SW 41 Ti (6×13.2 mL) | 41000 rpm | 287792 ×g 207150 ×g 126696 ×g | 153.1 mm 110.2 mm 67.4 mm | 124.0 | NVT 65 (8×13.5 mL) | 65000 rpm | 402000 ×g | 84.9 mm | 21.0 |
55039 rpm | 287792 ×g | 72.2 mm | 29.3 | ||||||
50636 rpm | 207150 ×g | 59.5 mm | 34.6 | ||||||
SW 40 Ti (6×14 mL) | 40000 rpm | 284123 ×g 201642 ×g 119339 ×g | 158.8 mm 112.7 mm 66.7 mm | 137.0 | NVT 65 (8×13.5 mL) | 65000 rpm | 402000 ×g | 84.9 mm | 21.0 |
54687 rpm | 284123 ×g | 72.2 mm | 29.7 | ||||||
49958 rpm | 201642 ×g | 59.5 mm | 35.5 | ||||||
采用5mL樣品管，梯度介質(zhì)和離心溫度均相同時，SW 55 Ti在最高轉(zhuǎn)速55000 rpm工作時，分離時間將是此轉(zhuǎn)速下NVT 65.2離心用時的2倍以上。而若采用NVT 65.2最大工作轉(zhuǎn)速運(yùn)行，則離心時間進(jìn)一步降低至SW 55 Ti轉(zhuǎn)頭用時的1/3。
超速離心機(jī)制造商開發(fā)NVT轉(zhuǎn)頭，真可謂用心良苦哈！
2.4 應(yīng)把握好NVT轉(zhuǎn)頭帶來的機(jī)遇
超速離心實(shí)驗(yàn)耗時冗長，少則數(shù)十分鐘，多則持續(xù)十幾小時甚至24小時以上。單臺機(jī)器可接待實(shí)驗(yàn)人次均明顯少于普通臺式低溫離心機(jī)。超離實(shí)驗(yàn)多的單位，超速離心機(jī)資源往往十分緊張。而新購超速離心機(jī)、添置轉(zhuǎn)頭升級的花費(fèi)不菲，眾所周知。
科研的研究對象繁雜，所用轉(zhuǎn)頭類型和工作條件難以統(tǒng)一。而超速離心轉(zhuǎn)頭有4種功能類型，每一種類型的轉(zhuǎn)頭按轉(zhuǎn)速、單管容量（4ml - 38.5mL）分為多個型號。超速離心機(jī)管理部門要將如許多種轉(zhuǎn)頭配齊，所需預(yù)算之浩大將超乎想象。而做到用盡可能少的轉(zhuǎn)頭配置滿足盡可能多的應(yīng)用需求，需要管理服務(wù)部門轉(zhuǎn)變觀念，充分了解每種轉(zhuǎn)頭的功能特性。這有利于發(fā)揮資源配置優(yōu)勢，提高設(shè)備服務(wù)效益。
中小企業(yè)超速離心應(yīng)用流程對轉(zhuǎn)頭性能的需求相對固定。通過提高超速離心機(jī)運(yùn)行效能，避免單純依靠增加設(shè)備數(shù)量的單一途徑來擴(kuò)大產(chǎn)能，是減輕設(shè)備投資成本壓力的有效解決方案。
資料表明，NVT類型的轉(zhuǎn)頭在超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭中資歷雖淺，但功能及應(yīng)用范圍，與使用頻次最高的水平轉(zhuǎn)頭并無二致。通過優(yōu)化運(yùn)行參數(shù)條件，用NVT轉(zhuǎn)頭承擔(dān)一部分水平轉(zhuǎn)頭的離心工作，從理論到技術(shù)上都具有可行性。
然而，實(shí)際工作中所用超速離心程序設(shè)置，或基于既有工作規(guī)范，或參考同類實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)提供的實(shí)驗(yàn)條件數(shù)制定。要充分發(fā)揮NVT轉(zhuǎn)頭多面手優(yōu)勢，首先要面臨的難題是：如何基于現(xiàn)有水平轉(zhuǎn)頭上的工作參數(shù)，制定樣品轉(zhuǎn)移到NVT轉(zhuǎn)頭高效離心的所需參數(shù)設(shè)置。
我們認(rèn)為，無論采用何種轉(zhuǎn)頭工作，運(yùn)行參數(shù)的設(shè)定須滿足兩個基本條件，首先是密度范圍有效，其次是離心力指標(biāo)有效。
密度范圍有效，是指在設(shè)定轉(zhuǎn)頭設(shè)定工作條件下，要確保樣品中各目標(biāo)組份在分離后都包含在梯度介質(zhì)溶液所形成的密度范圍內(nèi)，理想的密度梯度曲線還應(yīng)使分離組分聚集的條帶盡可能窄。
離心力指標(biāo)匹配，是指新的工作轉(zhuǎn)速對應(yīng)的最大與最小離心力要優(yōu)于或與原工作離心力等效，滿足樣品組分離心所需最低離心力條件。
下面以SW41水平轉(zhuǎn)頭和NVT65近垂直轉(zhuǎn)頭的密度梯度曲線對比圖為例予以說明。
采用相同初始濃度的CsCl梯度介質(zhì)溶液上樣、離心溫度統(tǒng)一設(shè)定為20℃。當(dāng)SW41轉(zhuǎn)速為30000rpm時，介質(zhì)自形成密度的范圍為1.19 ～ 1.87g/mL。當(dāng)轉(zhuǎn)速設(shè)定為35000rpm時，介質(zhì)密度范圍為1.06 ～ 1.86 g/mL。若將樣品轉(zhuǎn)移至NVT65上離心，只有轉(zhuǎn)速65000rpm對應(yīng)的介質(zhì)梯度范圍1.26 ～ 1.86 g/mL與SW41對應(yīng)的30000rpm工作條下梯度密度生成范圍最匹配，可以同時兼顧所有條帶的浮力密度范圍。
經(jīng)過簡單計(jì)算，30000rpm時SW41轉(zhuǎn)頭離心力范圍為67832 ～ 110934×g；轉(zhuǎn)速35000rpm時離心力范圍是92330 ～ 150993×g。而NVT轉(zhuǎn)頭在設(shè)定轉(zhuǎn)速條件下，離心范圍為281113 ～ 341040×g，均高于原離心力指標(biāo)，確保離心力可以使被分離組分有效離心。
上述兩個條件均不理想時，應(yīng)以密度梯度范圍的匹配作為優(yōu)先原則調(diào)整NVT轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速的設(shè)定。就此處案例而言，用NVT65轉(zhuǎn)速65000rpm取代SW41轉(zhuǎn)頭30000-35000rpm轉(zhuǎn)速離心，是切實(shí)可行的。
從表2可知， NVT65轉(zhuǎn)頭采用65000rpm工作轉(zhuǎn)速取代SW41轉(zhuǎn)頭30000rpm離心相同樣品時，在兩種情況下浮力密度接近的情況下，根據(jù)K因子與沉降系數(shù)離心時間評估方法，NVT65有效離心時間約為SW41轉(zhuǎn)頭的10%，可見優(yōu)化離心工藝對離心效率提升的巨大價值。
因此，在制定超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭配置方案時，在單管樣品容積同等條件下，角轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭和NVT轉(zhuǎn)頭及水平轉(zhuǎn)頭四者中，可將NVT轉(zhuǎn)頭作為優(yōu)先選項(xiàng)。
如NVT 65（8×13.5mL; 65000rpm）近垂直轉(zhuǎn)頭、Type 70.1 Ti（12×13.5mL; 70000rpm）角轉(zhuǎn)頭、VTi 65.1（8×13.5mL;65000rpm）垂直轉(zhuǎn)頭與水平轉(zhuǎn)頭SW 41 Ti（6×13.2mL; 41000rpm）SW 40 Ti （6×14mL; 40000rpm）之間，可首選NVT 65。
在水平轉(zhuǎn)頭SW 32 Ti（6×38.5mL; 32000rpm;k Factor=204）、SW 28（6×38.5mL; 28000rpm;k Factor=246）之間，按K因子值從低到高排序，可首選SW 32 Ti。
為盡可能照顧實(shí)驗(yàn)人員操作習(xí)慣、簡化管理服務(wù)工作，SW 32 Ti（6×38.5mL; 32000rpm）水平轉(zhuǎn)頭、VTi 50.1（12×39mL; 50000rpm）垂直轉(zhuǎn)頭和兩款角轉(zhuǎn)頭Type 50.2 Ti（12×39mL; 50000rpm）、Type 70 Ti（8×39mL; 70000rpm）中，SW 32 Ti優(yōu)先，可能會讓實(shí)驗(yàn)者更覺暖心一點(diǎn)。
在確保操作規(guī)范安全前提下，用優(yōu)化超速離心運(yùn)行參數(shù)設(shè)置的方法，可充分發(fā)揮NVT轉(zhuǎn)頭高效便利優(yōu)勢，迅速提升設(shè)備產(chǎn)能，大幅減輕設(shè)備操作和管理負(fù)擔(dān)，具有巨大經(jīng)濟(jì)社會效益，也是超速離心機(jī)管理者和使用者從我做起、踐行低碳節(jié)能工作理念的集中體現(xiàn)。
3、參考文獻(xiàn)
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