(續(xù)：生物醫(yī)學樣品微量紫外光度測定的技術(shù)原理和方法-上)

四、NanoDrop系列微量紫外分光光度計

       吸光度計算公式A =ε·b·c表明，在一臺光度計上測試同一個樣品，選用不同測試光程，則A260測定值不同。理論上，1.0mm光程的A260讀數(shù)相當于10mm光程模式讀數(shù)的1/10。若采用更短的0.1mm光程測試，A260讀數(shù)會進一步減小至標準光程的1%。

       將上述計算公式轉(zhuǎn)換一下，得到：

       c = A/(ε·b) ……................................. 公式2

       公式2表明，同一臺光度計、采用長短兩種光程，分別測得的2個樣品A260讀數(shù)相同時，短光程測定模式對應(yīng)的樣品實際濃度，要高于長光程測定模式下所測定樣品的真實濃度。

        換言之，在同一臺光度計檢測器的線性檢測范圍內(nèi)，短光程測定模式提高系統(tǒng)的吸光度測定范圍、樣品濃度測定上限。以Implen NanoPhotomete NP80、N60微量紫外可見光度計和C40常量紫外可見光度計為例：NanoVolume功能模塊（光程0.67mm/0.07 mm兩檔可調(diào)）與標準10mm光程比色皿測定模塊比，吸光度范圍上限和可測樣品濃度上限提升了125倍以上（2-3個數(shù)量級）。

       因此，高濃度樣品適合用短光程模式測定，而較低濃度的樣品可以嘗試采用標準10mm、1.0mm或0.1mm光程來檢測。這樣做目的是使吸光度讀數(shù)盡可能落在儀器檢測器吸光度線性響應(yīng)區(qū)間，減少誤差，提高測試精度。

       新型微量紫外可見光度計的1mm光程相當于常規(guī)紫外可見光度計標準10mm比色皿檢測光程的1/10。理論上，其可測的樣品濃度上限相當于標準比色皿測定上限的10倍。若要進一步提高可測樣品濃度上限，進一步壓縮樣品檢測光程是一行之有效的辦法。

       PCR反應(yīng)體系構(gòu)建過程中經(jīng)常用漩渦振蕩來充分混勻樣品，而同時使PCR管內(nèi)壁出現(xiàn)大量大小不等的液滴掛壁吸附。如此小的液滴，須離心處理才能將其回收。

       或許受此啟發(fā)來的創(chuàng)造靈感，Charles W. Robertson等人在2000年創(chuàng)建NanoDrop Technologies公司（已并入賽默飛公司），專門研究如何利用液體表面張力特性開發(fā)一款可利用0.5 ~ 1 μL體積樣品完成核酸測定的工具。功夫不負有心人，其首款產(chǎn)品NanoDrop 1000于2003年上市，獲得了巨大成功，并由此掀起了一場席卷全球的Drop-Style設(shè)計思潮。

       由于液體表面張力作用，微小液滴可在一定尺度內(nèi)被任意拉伸成高度、粗細不同的雙曲面柱體。測試光束從柱體中軸穿透時，光程長度可以被精確控制。這樣，不僅實現(xiàn)了將測試光程長度壓縮到1.0mm以內(nèi)的目標，還可以進一步劃定0.05mm、0.02mm、0.01mm等更多個亞毫米級的短光程。

NanoDrop系列微量紫外可見光度計檢測光程表

       通過多光程自動調(diào)節(jié)（auto-ranging），從而在應(yīng)對各種高濃度樣品測試挑戰(zhàn)時，從容不迫、時游刃有余。

       NanoDrop微量紫外可見光度計的光程auto-ranging具體細節(jié)，從官方資料無從可考。不過，原GE health care開發(fā)NanoVue Plus（現(xiàn)歸Biochrom公司）的技術(shù)資料，可讓我們窺視光程自動調(diào)節(jié)的一些端倪。

       NanoVue Plus有0.2mm或0.5mm兩檔測試光程可選：較低濃度樣品應(yīng)使用0.5mm的光程，較高濃度的樣品應(yīng)使用0.2mm的光程。在DNA、RNA、寡核苷酸、Tm計算、Cy染料、蛋白質(zhì)紫外光和蛋白質(zhì)A280方法中，由于事先樣品的濃度范圍未知，系統(tǒng)默認采用自動調(diào)整光程的功能選項。

       自動光程功能激活后，儀器首先進行樣品的0.5mm光程測量，如測得的吸光度高(>1.7A)，則系統(tǒng)自動調(diào)整為用0.2mm光程重新測量樣品，直至測試紙落入系統(tǒng)檢測器最適測定區(qū)間。在該功能模式下，樣品的掃描總是先后使用兩個光程進行。

       測試后的樣品濃度等，系統(tǒng)自動進行路徑長度和吸光度歸一化化(Pathlength and Absorbance normalization)處理，最后給出相當于標準10mm光程的修正值。

（待續(xù)）