基于應用的多功能熒光酶標儀選型-3

 （續(xù)：激酶活性HTRF檢測的熒光酶標儀解決方案-上）

二、HTRF技術對測試儀器系統(tǒng)的要求

       Cisbio Bioassays公司（2019年4月并入美國PE/PerkinElmer）不生產(chǎn)測試儀器，而是通過對PerkinElmer、Biotek、BMG、Molecular Devices、Tecan、Thermo Scientific等主流品牌制造商的多功能熒光酶標儀實施HTRF檢測資質(zhì)認證的方式，借船出海，讓HTRF技術應用一路保持著乘風破浪、行穩(wěn)致遠的態(tài)勢。

       為HTRF技術應用保駕護航的，是Cisbio為HTRF專利技術建立的一套檢測標準體系。該標準對測試用儀器硬件配置、系統(tǒng)工作參數(shù)設置和數(shù)據(jù)處理方法等都有完整而詳盡規(guī)定。

2.1 HTRF檢測對儀器硬件條件的要求

       HTRF技術是依托TRF、FRET兩種熒光分析方法建立的，故執(zhí)行HTRF測試的儀器，從光源、光路配置、檢測器及軟件系統(tǒng)設置，除要適應TRF、FRET檢測要求，還要符合HTRF檢測技術標準。

       HTRF抑或TRF，都基于測試信號與普通熒光、樣品背景熒光的衰減時間(fluorescence decay time)的巨大差異原理，在熒光激發(fā)和信號檢測兩個動作間引入一個50 - 150μs的檢測時間延遲，待被散射的激發(fā)光和短壽命樣品自發(fā)熒光自然消退殆盡，再測定FRET機制釋放的熒光信號。用時間門控的方法排除非特異熒光的干擾，來實現(xiàn)高信噪比、高靈敏度。此外，HTRF、TRF技術都用了鑭系元素離子型配合物作熒光標記，測試所用的激發(fā)、發(fā)射濾光片配置基本一致。只不過，HTRF需加一組檢測光學元件以測定第二發(fā)射熒光信號。而HTRF與FRET雖檢測原理方法一致，但具體細節(jié)則大相徑庭。

       歸納起來，滿足HTRF認證標準的多功能熒光酶標儀，硬件配置有以下特點。

2.1.1 檢測光源

       HTRF檢測光源可以采用閃爍氙燈（Xenon flash lamp）或高能激光器（TRF laser）。

       氙閃燈閃光頻率高（最大200Hz），波長分布范圍廣（240 -1200nm）。其中檢測常用的紫外（200-320nm）、可見光譜（430-680nm）兩個區(qū)間能量處于較高水平。而鑭系元素穴狀化合物激發(fā)波長為340nm。因此，氙閃燈用作HTRF檢測是經(jīng)濟易行的光源來源。但缺點是能量分布均勻，特別是320 - 340nm區(qū)帶的能量輻射相對較弱。

       而波長337nm的TRF激光器，能量集中，樣品激發(fā)充分，對強、弱兩種信號的辨識度增強，檢測的靈敏度和動態(tài)范圍都有改進。此外，每次快閃式激發(fā)結束后，能量消退迅速，沒有閃爍氙燈常見的能量消退“長尾”，故激光器脈沖引入的背景持續(xù)時間短、強度弱。只需更少激發(fā)頻次，即可達到檢測積分效果。實測表明，TRF激光器激發(fā)一次采集的熒光信號足以媲美常規(guī)氙閃燈激發(fā)10次采集信號積分效果，可在36秒內(nèi)完成1536孔板測定，有顯著速度優(yōu)勢并保持Z'>0.8的測試質(zhì)量。這是HTRF檢測系統(tǒng)引入TRF激發(fā)光源的價值所在。

2.1.2 傳輸光路

       HTRF檢測光路須是濾光片架構(filter-based)，通常系統(tǒng)配置專用一組340nm激發(fā)濾光套件(Excitation filter set)、620/665nm兩組發(fā)射濾光片組件(Emission filter set，含二色分光鏡)。VantaStar、FluoStar Omega、EnVision、SpectraMax iD5、Synergy NEO2、Infinite F Plex系統(tǒng)均采用此配置思路。

       MD的SpectraMax i3x、SpectraMax Paradigm多功能熒光酶標儀，因為采用的光源-光路集成式卡盒式模塊化設計，因此只需選擇HTRF專用檢測卡盒(0200-7011)，其內(nèi)置符合Cisbio HTRF測試標準的氙閃燈、傳導光路設計和616nm, 665nm兩組特異性發(fā)射濾光片，可實現(xiàn)即插即用。

2.1.3 信號檢測器

       HTRF與FRET、BRET檢測，都需對能量的供體、受體兩個發(fā)射熒光信號進行采集測定。理論上，為避免樣品因時間不同、激發(fā)能量波動、檢測器自身工作暗電流波動產(chǎn)生的噪音干擾，兩組信號應該實施同步測量。為此，通常測試儀器要求是雙重濾光光路、雙PMT配置來并行測量 2 個發(fā)射波長，即同步雙發(fā)射(Simultaneous Dual Emission，SDE)測定。主流品牌多功能熒光酶標儀中，BMG VantaStar、FluoStar Omega、Polarstar Omega、PerkinElmer EnVision HTS和Agilent BioTek Synergy NEO2屬于這種情況。

       SDE不僅降低測試值%CV，同時更有利于HTS應用。實際上，HTRF技術開發(fā)過程中，正是依托SDE檢測平臺進行的。

       目前，除經(jīng)典SDE同步測定方法，非同步測定方法——Two sequential measurements（TSM）也已被Cisbio HTRF標準體系采納。所謂TSM，即兩種熒光信號按（受體）發(fā)射熒光—供體發(fā)射熒光的順序分為兩次、連續(xù)循環(huán)測定方法（Sequentially measure the two emissions one after the other）。

       HTRF檢測中，Eu³⁺等鑭系元素穴狀化合物發(fā)射熒光壽命不過1000 μs，而測試儀器PMT檢測時間窗口（Window time or Integration time）長達400-600 μs，已基本覆蓋或代表了的黃金采樣窗口。在一個采樣循環(huán)時間內(nèi)，顯然無法按順序依次完成供體熒光、受體熒光信號采集。故兩種信號的測定只能分步進行：第一個激發(fā)周期（cycler或flash）的600μs窗口檢測供體信號，第二個激發(fā)周期采集受體熒光信號。只要確保每個采樣周期設定參數(shù)一致，系統(tǒng)工作狀態(tài)基本穩(wěn)定，則從兩個連續(xù)周期分別測得的兩個熒光信號，與在一個周期內(nèi)同時采集的兩種熒光信號，理論上等效。Tecan Infinite F200 PRO 、MD SpectraMax iD5系統(tǒng)的HTRF認證測試程序中， 620 nm、665 nm兩種信號數(shù)據(jù)就是基于TSM模式得來的。

       這表明，作為TR-FRET技術中特例，HTRF檢測檢測數(shù)據(jù)，既可以用經(jīng)典SDE方法測定產(chǎn)生，也可以是TSM非同步連續(xù)測定完成。這等于宣示：造價相對低廉的單PMT配置系統(tǒng)同樣可以申請HTRF檢測認證。

2.2 HTRF檢測對應用程序設置的要求

       Cisbio對MD、Tecan、PE、BioTek和BMG等品牌測試儀器的HTRF認證應用程序，會因各儀器配置、技術性能、默認運行參數(shù)設置不一，實行了個性化量程定制的HTRF檢測協(xié)議，以確保檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量符合Cisbio的信噪比、DF%、CV%、靈敏度和動態(tài)范圍等多項認證標準。資料顯示，即便是相同HTRF應用，如Europium cryptate donor/ Red acceptor readout，不同儀器HTRF測試協(xié)議中諸多參數(shù)設置互不兼容。

       我們首先看看HTRF檢測協(xié)議都有哪些核心要素。

2.2.1 檢測脈沖數(shù)（Number of flashes）

       在對單個樣品測定過程中，激發(fā)光源的一個開啟激發(fā)關閉動作、一個短暫待機和檢測器的一個啟動信號采集到停止動作，這三個內(nèi)容組成的一整套測試活動可稱為一個閃光（flash）、脈沖（pulse）、讀數(shù)（read）或一個檢測循環(huán)周期（cycle）。

       每一個樣品孔通常都包括許多個重復脈沖動作。不同儀器設定的脈沖數(shù)有差別（10-200個）。

2.2.2 激發(fā)時間（Excitation Time）

       激發(fā)光源在每個脈沖中持續(xù)工作激發(fā)樣品時間，稱為激發(fā)時間。

       HTRF檢測中，閃爍氙燈用的是50μs固定時間，確保樣品充分激發(fā)。高能激光器脈沖激發(fā)能量集中而強度高，檔次激發(fā)時間可縮短至數(shù)微秒。

2.2.3 檢測延時（Integration delay/Measurement delay/Lag time）

       激發(fā)光源關閉后、檢測器啟動熒光信號采集前有一段無光電操作的空白時間，稱為時間延遲。

       通過測量時間延遲，就可以在激發(fā)光、待測樣品基質(zhì)自發(fā)短壽命熒光（1-10ns）全部衰變后，消除其干擾，得到背景極低而信噪比極佳的特異性熒光強度測值。

2.2.4 檢測時間（Integration Time）/信號采集窗口時間(time of windows）

       是指在一個脈沖中，從檢測器啟動信號采集工作到結束信號采集這段時間長度，稱為積分時間或檢測窗口期。

       每個樣品孔要歷經(jīng)10次以上的脈沖，而每個脈沖的積分時間是固定的。

       PMT光譜響應特性（同一個制造商生產(chǎn)同一種型號光電倍增管，光譜響應特性也不完全一樣）、量子效率（Quantum Efficiency）、暗電流變化（限制了對弱光信號的檢測的分辨能力，即靈敏度）、信號響應時間（把光脈沖轉(zhuǎn)換并輸出光電脈的時間，約10ns）等性能影響對測量結果大。積分時間需綜合信號強度、暗電流噪音、Delta F幾個指標動力學特性才能確定。最佳積分時間方案是噪聲最小化的同時Delta F 最大化。資料顯示，SpectraMax iD5系統(tǒng)最佳積分時間為在500 μs至1000 μs范圍內(nèi)，噪聲最小化而Delta F較高。

       測試表明，隨著脈沖次數(shù)增加，Delta F 值顯示出變異性較小趨勢（CV 越好），同時背景噪音減少，檢測限提高。因此，優(yōu)化每孔樣品的積分時間和脈沖數(shù)這兩個參數(shù)可提示系統(tǒng)檢測性能。

       每個樣品測度時間為（測試板位置機械移動、定位的時間不計入）：

        （延遲時間+積分時間）×脈沖數(shù)量 = 單孔樣品檢測時間。

2.2.5 信號增益調(diào)節(jié)（Gain）

       Gain即光電倍增管的增益。PMT通過光電陰極面接收光信號將光子能量轉(zhuǎn)換成光電子后，經(jīng)過多次聚集、加速、轟擊而實現(xiàn)電子數(shù)目疊加倍增，在PMT陽極端輸出電流，而PMT的輸出電流大小和入射光子數(shù)成正比。

       PMT增益用末端輸出電流與前段陰極電流比值表示，可理解為電流的倍增率。通常，增加PMT陰陽兩極的工作電壓，則增益增加。

       PMT自動增益調(diào)節(jié)功能，是指儀器根據(jù)樣品信號強度，自動選擇合適的PMT工作電壓。此外，PMT允許手動增益優(yōu)化設置。增益調(diào)節(jié)的作用是系統(tǒng)可在一定數(shù)量級別內(nèi)同時穩(wěn)定測定高、低信號相差7個數(shù)量級上的不同樣品。

2.2.6 Z軸高度調(diào)整（Z-position）/讀板高度（Read height）

       HTRF檢測要將高能激發(fā)光源、測試探頭都精準聚焦于樣品上，以實現(xiàn)有效激發(fā)和信號采集。Z軸-聚焦調(diào)整功能，能優(yōu)化讀板的Z-高度，以適應不同通量、孔樣品直徑、樣品頁面高度的測試板的檢測，減少測試信號損失，并降低孔間串擾。

表1 Cisbio HTRF認證的HTRF檢測專用參數(shù)設置

       根據(jù)表1內(nèi)容，我們可以作如下解讀：

       1）不同品牌多功熒光能酶標儀的檢測脈沖數(shù)、延遲時間、積分時間不同，使得單孔樣品檢測效率不同。按HTRF檢測速度從高到低將表中五款機型排序，結果是：Infinite F200 PRO ＞Synergy NEO2 ＞ EnVision HTS ＞ SpectraMax iD5 ＞ FluoStar Omega；

       2）依據(jù)單孔樣品信號檢測時間參數(shù)，按測試靈敏度從高到低這5款機型排序結果為：FluoStar Omega ＞ EnVision HTS ＞ SpectraMax iD5 ＞ Synergy NEO2 ＞ Infinite F200 PRO；

       3）為Ciobio HTRF檢測建立的標準測試protoco中，延遲時間、積分時間、脈沖次數(shù)之間存在制約、互補關系。以FluoStar Omega、Polarstar Omega為例，雖然時間延時少（60 μs），積分時間短（400 μs），但脈沖次數(shù)多（200次）。而SpectraMax iD5時間延時長（100 μs），積分時間長（600 μs），但脈沖次數(shù)少（50次）。因此，確保每個樣品的總積分效果在不同平臺間測試結果的可比性、可靠性。這正是Cisbio HTRF認證創(chuàng)建個性化檢測協(xié)議的魅力和意義之所在。

       相比為各品牌不同型號的多功能熒光酶標儀擬定千篇一律測試協(xié)議的指南規(guī)范，Ciobio的HTRF標準體系采用“一機一議、因機施策”的方法，顯然更科學嚴謹、更具可行性。

 (續(xù)：激酶活性HTRF檢測的熒光酶標儀解決方案-下)