目前，各國腦科學(xué)計劃的一個核心方向就是打造用于全景式解析腦連接圖譜和功能動態(tài)圖譜的研究工具。其中，如何打破尺度壁壘，融合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動與大腦整體的信息處理和個體行為信息，是腦科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

在國家自然科學(xué)基金委重大科研儀器研制專項《超高時空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下，由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所聯(lián)合北大信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院電子學(xué)系、工學(xué)院以及中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院等組成的跨學(xué)科團(tuán)隊，在Nature Methods 發(fā)表[Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane, and long-term brain imaging]。這是繼2017年第一代新型微型化雙光子顯微鏡FHIRM-TPM之后的又一重大突破。

FHIRM-TPM 2.0成像視野擴大至420×420平方微米，微型物鏡的工作距離擴展至1毫米，以實現(xiàn)非侵入式成像；嵌入了可拆卸的快速軸向掃描模塊，實現(xiàn)了180微米深度的三維體成像和多平面快速切換的實時成像。該模塊由一個快速的電動變焦透鏡和一對中繼透鏡組成，在不同深度成像時保持放大倍率恒定。其中，變焦模塊重量1.8克，研究人員可根據(jù)實驗需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探頭還可整體即時拔插，極大地簡化了實驗操作，避免了長周期實驗時對動物的干擾。在重復(fù)裝卸探頭跟蹤同一批神經(jīng)元時，視場旋轉(zhuǎn)角小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米。

一、FHIRM-TPM 2.0系統(tǒng)的設(shè)計，低倍率大FOV物鏡的頭架和性能測試。

帶插圖的顯微鏡設(shè)計，顯示了FHIRM-TPM 2.0頭盔的輪廓。ETL：電子可調(diào)鏡頭；HC-920：空心光子晶體光纖，可傳輸920 nm飛秒激光脈沖；HWP：半波片；MEMS：微機電系統(tǒng)；PMT：光電倍增管；SFB：柔軟的纖維束。

ZEMAX模擬頭戴式耳機中的光學(xué)組件。圖c，視場 MEMS的掃描角度為±4.5°，焦平面中的掃描FOV為?420 μm×420 μm（xy）。圖d，通過改變ETL的屈光度來改變焦平面。ETL的掃描范圍為±30屈光度，相應(yīng)的聚焦范圍為?±90 μm（z）。

圖e，物鏡的照片（3x，NA 0.5）。圖F，F(xiàn)OV和失真測試使用100 μm網(wǎng)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。虛線正方形勾勒出與MEMS掃描場相對應(yīng)的420μm×420μm區(qū)域。圖g，使用標(biāo)準(zhǔn)USAF1951分辨率測試目標(biāo)進(jìn)行空間分辨率測試。光源是中心波長為940 nm的光纖耦合LED。圖h，沿g所示的交叉線的強度分布。

 二、 FHIRM-TPM安裝和拆卸設(shè)計。

  圖a底板（頂部）和支架（底部）的示意圖。b，示意圖說明頭戴裝置安裝在基板組件上，以及固定在慢性顱窗玻璃蓋玻片上的支架。

安裝，拆卸和重新安裝耳機。步驟1，將帶有蓋玻片的基板用牙膠固定在顱窗上。步驟2，放置頭戴式耳機。首先將頭戴螺絲固定在其支架上，然后使用三軸電動平臺將其放置在底板上。一旦找到感興趣的區(qū)域，就用牙科用膠粘劑將支架固定到基板上。步驟3，通過旋松并從固定器上拔下耳機來進(jìn)行拆卸。步驟4，要重新安裝，在底板的蓋玻片上放一滴水；然后，將耳機插入并用螺絲固定到支架上。

 三、ETL的性能測試。

1. 測試系統(tǒng)示意圖。ND，中性密度；ETL，電子可調(diào)鏡頭；PD，光電探測器。b，使用放置在ETL下方一定距離（h）的PD耦合光纖進(jìn)行ETL屈光度測量的原理。對于準(zhǔn)直的入射光束，藍(lán)線表示ETL正屈光度處的會聚出射光束，綠線表示負(fù)屈光度處的發(fā)散出射光束。

圖片顯示了清醒的狀態(tài)下表達(dá)GCaMP6s的小鼠的額葉皮層和樹突的樹突和棘,比例尺為30μm（左）和5μm（右）

 FHIRM-TPM 2.0擴大了微型雙光子顯微鏡的適用性和實用性，使神經(jīng)科學(xué)家能夠更自由地探索更多新的行為范式，可用于在動物覓食、跳臺、打斗、嬉戲、睡眠等自然行為條件下，或者在學(xué)習(xí)前、學(xué)習(xí)中和學(xué)習(xí)后，長時程觀察神經(jīng)突觸、神經(jīng)元、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、遠(yuǎn)程連接的腦區(qū)等多尺度、多層次動態(tài)變化。如學(xué)習(xí)和記憶，社會互動和恐懼條件反射，甚至是慢性疾病的進(jìn)展和老化，如神經(jīng)發(fā)生和再生，疾病進(jìn)展和衰老，以破譯大腦的奧秘。

論文鏈接 ： https://www.nature.com/articles/s41592-020-01024-z