操作規(guī)程
多區(qū)肝臟類器官實驗報告信息與歐盟MIAOU標準的對照分析
肝臟是人體最大的消化腺和重要代謝調控中心，不僅肝臟合成并分泌膽汁酸幫助消耗食物，還參與蛋白質、脂類和糖元等物質的合成和分解，作為解毒中心，還參與激素、藥物和乙醇等的轉化和解毒。在此過程中，肝臟也容易因病毒感染、過量飲酒、炎癥、代謝性因素、遺傳變異以及惡性腫瘤等多種原因引起的損傷，導致肝臟功能逐漸下降并最終發(fā)展為終末期肝病。而治愈終末期肝病唯一方法是進行器官移植。遺憾的是，可移植供體肝臟的需求遠超供應，不僅導致約20%患者因缺少肝臟來源而死亡，在等待供體器官的過程給患者帶來了巨大的心理負擔的同時，還可能對患者的預后產生負面影響。因此，人類自體肝臟類器官人工生成品是供體肝臟替代方案非常有前途的解決途徑。
2025年4月16日， Nature 刊發(fā)了題為《用人多能干細胞生成的多區(qū)肝臟類器官》(Multi-zonal liver organoids from human pluripotent stem cells)的研究報告（以下統(tǒng)一簡稱為“多區(qū)肝臟類器官”），宣告肝臟類器官實驗技術實現(xiàn)了里程碑式跨越——具有類似于人體肝細胞代謝區(qū)域化特征的多區(qū)人肝類器官的誕生。文章出自美國辛辛那提兒童醫(yī)院Takanori Takebe領導的研究小組，最早于2024年8月30日以“Self-Assembled Generation of Multi-zonal Liver Organoids from Human Pluripotent Stem Cells”題名在bioRxiv在線發(fā)表。有趣的是，此文的通訊作者Takebe，正是《Nature》2013年一篇Research Letter《Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant》、2014年7月 Nature Protocols Article《Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant》的第一作者。
2024年開發(fā)的多區(qū)人肝類器官[1]與2013年構建人肝臟類器官[2-3]比，在關鍵技術上的迭代3點。首先，鑒于人類和其他靈長類動物細胞的L-抗壞血酸合成酶基因，L-古洛糖酸內酯氧化酶（L-gulono-γ-lactone oxidase, GLO），發(fā)生了嚴重突變，缺少了嚙齒動物基因序列中存在的多個外顯子而成為一個假基因(pseudogene)，導致體內自行合成L-抗壞血酸（維生素C）。故用AAV載體將搭載了小鼠 Gulo (mGulo)基因的四環(huán)素(TET)誘導表達系統(tǒng)敲入人hiPSC細胞，以激活門靜脈周圍肝細胞的身份。第二，先分別構建門管區(qū)肝類器官和中央靜脈周圍肝類器官后，再將兩個類器官共培養(yǎng)，經自我組裝和融合，衍生了具有三分區(qū)的類器官組裝體。第三，也是最根本突破，在于類器官組裝體具備了人體肝臟那樣沿門管區(qū)-中央靜脈軸細胞代謝功能分區(qū)的特征。
我們簡單回顧一下肝類器官技術的歷程，就很容易理解多區(qū)人肝類器官技術的進步價值。
一、多區(qū)肝類器官組裝體之前的肝臟類器官技術研究進展
肝臟由肝實質細胞（parenchymal cells）和肝臟非實質細胞 （Liver non-parenchymal cells, NPC）組成。肝實質細胞，即肝細胞(Hepatocyte)執(zhí)行，構成肝臟質量的 80% 和細胞組成的 60%是肝代謝功能的主要承擔者。肝臟非實質細胞起支持肝細胞功能的作用，有多種細胞類型，包括肝內皮細胞（liver endothelial cells, LEC）、肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSC)、膽汁上皮細胞或膽管細胞(biliary epithelial cells or cholangiocytes)、庫普弗細胞(Kupffer cells)和其他免疫細胞群。
人體肝實質與非實質細胞在空間上排列成六邊形的肝小葉（liver lobules），是肝臟結構和功能的基本組成單元。肝動脈的分支——小葉間動脈血富含O2、激素（如胰島素和胰高血糖素）及代謝產物。門靜脈的分支——小葉間靜脈血提供從胃腸道吸收的葡萄糖、脂肪酸、維生素等營養(yǎng)和藥物成份。氧氣、激素和營養(yǎng)物質的血液從肝小葉的門管區(qū)（portal area）進入，在肝小葉內部血竇（hepatic sinusoid, LU）、竇周隙（persinusoidal space, PS）內進行物質交換后匯入中央靜脈（central vein, CV）。而經干細胞轉化生產的膽汁酸則進入膽小管從小葉中心向門管區(qū)流動并排出肝臟[4]。
此前，體外構建肝臟類器官主要有肝細胞膽管類器官、血管化肝類器官和肝臟類器官芯片三種類型，技術定位于盡可能模擬肝臟的組織構造和蛋白質合成、膽汁分泌等基本生理功能。
2015年，科學家用人肝臟分離的原代人EpCAM+細胞經體外懸浮培養(yǎng)成功構建出具有典型膽管狀結構肝臟類器官[5]。此后，用人胚胎干細胞誘導分化的肝祖細胞經三維培養(yǎng)建立了肝臟類器官，不僅具有肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha, HNF-4α)、細胞色素P450 家族1亞家族A1成員 (cytochrome P450 family 1subfamily A member 1, CYP1A1)、白蛋白(albumin)、三磷酸腺苷結合轉運蛋白C 超家族成員2(ATP-binding cassette subfamily C member 2, ABCC2) 等成熟肝細胞典型標志物，還在解熱鎮(zhèn)痛藥物乙酰氨基酚（acetaminophen,APAP）肝毒性測試中表現(xiàn)出類似于原代肝細胞（Primary Human Hepatocyte, PHH）的劑量依賴反應[6]。
缺少血管循環(huán)網(wǎng)絡的肝臟類器官與真實肝臟生理環(huán)境尚有差距。為此，研究人員進行了構建具有血管化結構肝臟類器官的嘗試。Takanori Takebe等將iPSC誘導形成的肝內胚層細胞、人臍靜脈內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）和人骨髓間充質干細胞 (human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)共同培養(yǎng)，生成具有三維球狀組織的肝芽(liver bud)——人血管化肝臟類器官。將其移植入免疫缺陷的小鼠體內48小時后,肝芽與宿主血管互連形成復雜血管網(wǎng)絡, 并實現(xiàn)血管網(wǎng)有效血液灌注[2,3]。
在靜態(tài)培養(yǎng)體系構建血管化多細胞類型肝類器官基礎上，近年，肝臟類器官芯片陸續(xù)面世，以適應肝癌、非酒精性脂肪肝的基礎研究和高通量抗肝癌藥物篩選體外模型應用需求。肝血竇芯片含有類似肝臟的血流環(huán)境和維持肝臟生理功能的多種細胞類型，可通過微流控技術動態(tài)調整液體流量及物質輸送。而基于肝小葉的生理結構和功能，構建包含門靜脈、肝動脈和中央靜脈三條血管通道和六棱柱體式細胞培養(yǎng)室的肝小葉芯片，不僅具有多樣化細胞組成類型，還實現(xiàn)了肝門靜脈和肝動脈實現(xiàn)雙重供血。運用肝小葉類器官芯片首次模擬了非酒精性脂肪性肝?。╪on -alcoholic fatty liver disease, NAFLD）中肝小葉中的脂質分區(qū)進展[6]。
多區(qū)肝臟類器官的研究愿景并建立可用于糖尿病、藥物性肝損傷、酒精相關肝病等疾病發(fā)病機制和肝病藥物篩選模型的體外細胞模型，而是實現(xiàn)用患者自體細胞培養(yǎng)出能取代異體捐贈肝臟、直接用于肝移植治療的再生醫(yī)學目標。這要求用人類干細胞衍生出的肝類器官與人體肝臟組織結構、細胞組成類型、代謝功能（包括谷氨酰胺合成、氨代謝、尿素循環(huán)、脂質和葡萄糖等）完整性、血液與膽汁流向與人體肝臟的高度一致。
二、多功能區(qū)肝臟類器官組裝體技術的開創(chuàng)性
血液、膽汁酸從肝小葉外圍的門管區(qū)到中央靜脈區(qū)流動是一個復雜物質交換過程。沿門管外圍-中央靜脈外圍軸（periportal-pericentral axis），形成氧氣、營養(yǎng)物質、激素及代謝廢物濃度的梯度分布區(qū)，即：血流中O2、葡萄糖、膽固醇（Cholesterol）等營養(yǎng)物質濃度從肝小葉外緣向中央靜脈方向梯次降低，而激素及氨、膽汁酸(Bile acid)、尿素等代謝物的濃度則在這一方向上漸次升高[4]。
與物質濃度梯度分區(qū)模式相應的是，肝小葉內部的葡萄糖異生作用(gluconeogenesis)、脂肪酸β氧化(β-oxidation)、尿生成(Ureagenesis)、蛋白質分泌(Protein secretion)和糖酵解（glycolysis）、脂肪生成（lipogenesis）、谷氨酰胺合成（Glutamine synthesis）等代謝功能，沿著物質梯度軸呈現(xiàn)異質性（hepatic functional heterogeneity），或稱為代謝通路的空間區(qū)室化（spatial compartmentalization of metabolic pathways）。譬如，門靜脈周圍肝細胞中糖異生和脂肪酸氧化的活性較高，中央靜脈周圍細胞中的糖酵解和藥物代謝升高。在哺乳動物肝臟中，肝細胞的代謝和功能因在肝小葉內的位置不同而存在差異，即肝細胞功能空間異質性，稱為肝臟分區(qū)（zonation）?？茖W界通常將肝小葉內部差異化代謝功能區(qū)分為三個，即圍繞肝動脈和門靜脈區(qū)域的門管周邊區(qū)(periportal areas, zone 1)，靠近中央靜脈的中央靜脈周邊區(qū)(pericentral areas, zone 3)和介于這兩者之間的小葉中間區(qū)(mid-lobular areas, zone 2)。門靜脈區(qū)（1區(qū)）執(zhí)行糖原和膽固醇的合成、膽汁酸代謝和氨轉化為尿素的功能，參與糖原儲存和膽汁酸代謝。中央靜脈周邊區(qū)域（3區(qū)）細胞執(zhí)行CYP450酶主導的解毒和藥物代謝，脂質氧化反應和谷氨酰胺合成。而處于1、3區(qū)之間的肝小葉中間區(qū)（2區(qū)）為功能過渡區(qū)，兼1區(qū)、3區(qū)部分功能，具肝再生潛能。涉及肝臟分區(qū)的非肝實質細胞專屬，肝血竇內皮細胞和竇周隙的肝星狀細胞集群同樣呈現(xiàn)出梯度變化，其基因表達和染色質可及性在不同區(qū)域存在顯著差異[4, 7-8]。
肝小葉內部養(yǎng)分與代謝物濃度梯度分布的生理微環(huán)境（microenvironment）塑造了肝細胞分區(qū)，造成肝分區(qū)細胞表觀遺傳特征，如DNA甲基化或染色體構象的差異，決定了肝細胞基因表達譜和生理功能的空間異質性。大量研究表明，包括膽紅素、代謝激素、O2、營養(yǎng)物質和形態(tài)發(fā)生素(morphogen)濃度等多種因素，通過激活Wnt家族分子（與3區(qū)肝細胞正確分區(qū)有關）、Hedgehog和Notch信號通路（與1區(qū)肝細胞和膽管細胞分區(qū)有關），調控了肝臟相關代謝功能基因的表達，決定肝細胞代謝區(qū)帶命運。[7,8]迄今為止，決定細胞分區(qū)命運的主要轉錄調節(jié)因子未明確。在體外復制動物和人類肝臟功能分區(qū)的多細胞類型類器官的探索，在科學界尚無先例。
表觀遺傳學和轉錄組學分析顯示，肝臟細胞的3分區(qū)是由抗壞血酸或膽紅素依賴的內源性組蛋白乙酰轉移酶p300與甲基胞嘧啶雙加氧酶TET1（通過將 5-甲基胞嘧啶羥化成 5-羥甲基胞嘧啶完成DNA的主動去甲基化修飾）或低缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF1α)機制調控的。L-抗壞血酸（Ascorbic Acid）即維生素C（Vitamin C），可調節(jié)肝臟1區(qū)多個特異性肝細胞基因的表達，增強包括糖異生、膽固醇合成和脂肪酸氧化等功能，同時抑制3區(qū)肝細胞的脂生成。因此，采用穩(wěn)定的抗壞血酸暴露可以促進靠近門管區(qū)細胞特定代謝途徑基因的表達[1]。
膽紅素（Bilirubin）是血液中衰老紅細胞中的血紅素經脾臟代謝后生成代謝廢物，經肝臟轉化為膽汁酸經膽管排放入腸道后隨著糞便排出體外。膽紅素可以直接或通過Wnt信號激活間接促進第3區(qū)特異性CYP酶的表達，增強位于3區(qū)域代謝活動的潛力。膽紅素也能激活HIF1α的轉錄和翻譯，模擬低氧條件效應，維持第3區(qū)特異性程序的表達。
基于膽紅素和抗壞血酸能夠通過促進表觀遺傳和轉錄程序的發(fā)展而定義了肝細胞分區(qū)身份的認識。研究人員采用L-抗壞血酸（主要靶向1區(qū)細胞）-膽紅素（主要靶向3區(qū)細胞）的簡單組合，分別對誘導兩組來自人誘導多能干細胞誘導生成肝祖細胞，再通過共培養(yǎng)的富含抗壞血酸培養(yǎng)基、膽紅素培養(yǎng)基暴露的肝祖細胞，生成自組裝、精確模擬人體肝臟3分區(qū)細胞差異性表型的肝類器官組合體，標志著在實驗室培養(yǎng)出準確模仿人類肝功能的肝組織技術實用化邁出了重要一步。移植人類類器官緩解接受膽管結扎、免疫抑制模型大鼠的高氨血癥和高膽紅素血癥，提高了其生存率。
三、多區(qū)肝臟類器官組裝體構建實驗主要內容
多區(qū)肝臟類器官一文實驗部分主要包括人源iPSC干細胞準備、Z1區(qū)、Z3區(qū)類器官培養(yǎng)和組合式奪區(qū)類器官構建、類器官功能表征的工作[1]。
3.1類器官的生成
人源iPSC干細胞材料準備：
干細胞材料中的對照組的1383D6 和 RCL-BC iPSCs 由京都大學 CiRA 友情提供。實驗組iPSCs 72.3 和 72.3-GFP 是由陰莖包皮環(huán)切術廢棄組織分離的成纖維細胞重編程為 iPSCs，并經慢病毒介導mGulo基因敲入改造而來。
類器官生成：
簡言之，將p40 iPSC培養(yǎng)分化后，使用Accutase處理將細胞解離成單細胞懸液。將該單細胞懸液與50%基質膠和50% EP培養(yǎng)基混合，并在6孔板中接種后以產生類器官。
多區(qū)域人肝臟類器官組裝體（mZ-HLO）的生成：
分別用低濃度膽紅素、抗壞血酸處理未成熟的類器官生成GLUL+肝細胞Z3-HLOs，CPS1+肝細胞的Z1-HLOs，最后將Z3-HLO和Z1-HLOs類器官按數(shù)量1:2的比例共培養(yǎng)生成帶有三個細胞區(qū)帶特征的組合式多區(qū)域人肝臟類器官(mZ-HLOs)。收獲的Z3-HLO、Z1-HLOs和mZ-HLOs用于下游表征分析。
3.2 多區(qū)域人肝臟類器官的主要表征內容
類器官活細胞延時成像：類器官實時成像，每30分鐘成像一次，持續(xù)7天，觀察類器官融合需要觀察細胞骨架、脂質轉運的功能。
類器官免疫染色成像：類器官免疫組化方法處理，在共聚焦激光掃描顯微鏡上成像。
蛋白表達檢測：將類器官解離裂解，提取總蛋白用于L-古洛諾內酯氧化酶ELISA測定。
肝細胞代謝物檢測：通過收集用膽紅素處理的HLO的上清液和大鼠的血清，用膽紅素檢測試劑盒測定膽紅素；收集HLO，接種到96孔測定板中，用細胞抗氧化檢測試劑盒測定細胞抗氧化水平、氮相關代謝物(用谷胱甘肽、氨、尿素、谷氨酰胺、葡萄糖和甘油三酯測定試劑盒)測定。
代謝活性檢測：通過收集HLOs，將接種到96孔板中，進行細胞色素P450酶家族中的CYP3A4和CYP1A2藥物代謝酶檢測、細胞培養(yǎng)上清中人類Notch1信號通路報告基因檢測、氮代謝相關酶（谷氨酰胺合成酶、谷胱甘肽S轉移酶、脂肪酶和葡萄糖激酶）活性檢測。裂解HLO，用Caspase-3比色檢測試劑盒進行細胞凋亡檢測。
帶狀毒性測定(Zonaltoxicityassay)：HLOs的烯丙醇、3區(qū)乙酰氨基酚毒性、mZ-HLO再生潛力測試，用細胞裂解物測試Caspase3活性。用CellTiter-Glo熒光細胞活力測定檢測活細胞數(shù)量。
基因表達分析：
對不同分區(qū)細胞功能基因表達的RT-qPCR檢測中，Dox誘導的Z1-HLO中ACSS2、ASL、CPS1和OTC基因的表達水平上調，抗壞血酸誘導促進了Z1-HLO中CPS1+門周區(qū)肝細胞分化。
RNA-seq是一種高通量測序技術，能對單個細胞、特定功能狀態(tài)下包括mRNA、rRNA、 tRNA、microRNA及其他各種非編碼 RNA(ncRNA)在內所有轉錄產物進行定量分析。通過對測序數(shù)據(jù)進行分析，可以獲得特定樣品基因表達研究和轉錄層面全面信息。RNA-seq分析表明，A1AT、HNF4A 和 CEBPA 等泛肝細胞標志基因在 Z1 和 Z3-HLO 中均一致表達。Z3-HLO中GHR、BCHE和 RCAN1等中央靜脈區(qū)特異性基因表達水平高，而 Z1-HLO則表達ACSS2、SLBP和 RND3。
ChiP-reChIP、ChiP-qPCR和ChIP-seq分析
染色質免疫共沉淀技術（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是一種用于研究體內蛋白質與DNA相互結合的方法。通常先用甲醛處理活細胞固定DNA-蛋白質復合物，再用工具酶將染色質切成無數(shù)個染色質小片段，基于抗原-抗體特異性結合原理，用抗體將含有目標蛋白的染色質片段提取富集后，再將結合的蛋白質、DNA解離以獲得純化DNA片段。ChIP與PCR、qPCR聯(lián)用，可確認DNA序列與特定蛋白間的結合。將ChIP與NGS測序結合（ChIP-Seq技術），對富集到的全部DNA片段進行測序，可在全基因組范圍內檢測與特定組蛋白、轉錄因子等結合的潛在DNA位點。ChiP技術可從研究單一目標蛋白與已知靶序列間的結合，發(fā)展到單一目標蛋白與整個基因組內未知序列的相互作用、兩種或多種蛋白復合物與單一DNA序列的相互作用（即ChIP-reChIP方法，是將第一輪ChIP富集到的蛋白-DNA復合物繼續(xù)進行第二種蛋白的免疫沉淀，從而得到與同一個DNA序列結合的兩種不同蛋白）。
通過組蛋白特異性抗體，將帶有特定修飾的組蛋白-DNA復合物沉淀，獲取的組蛋白可確定組蛋白修飾相關的DNA特定位點和組蛋白修飾酶靶標。因此，ChiP技術是表觀遺傳學中檢測轉錄因子與特定基因啟動子相互作用，組蛋白乙?；c染色質的開放和轉錄調控的重要方法。
ChIP-seq 分析顯示，組蛋白乙酰轉移酶EP300與mZ-HLO中的7875 個結合位點的結合增加，可乙?；鰪娮訁^(qū)并激活轉錄，導致肝母細胞分化和干細胞分區(qū)差異化轉錄。
單細胞核轉錄組測序（Single Nuclei RNA Sequencing，snRNA-seq）分析
細胞核RNA中含有大量的非編碼序列，其中包含基因間區(qū)序列和的內含子序列。snRNA-seq分析用于單個細胞水平的細胞核RNA檢測，較好地保持了細胞原始狀態(tài)和特性，適用于研究細胞表型鑒定。將snRNA-seq和細胞軌跡分析結合，用 snRNAseq 數(shù)據(jù)集表征不同的肝細胞身份，闡明細胞功能相關基因集。而根據(jù)基因的表達狀況把樣本分為多個分化狀態(tài)下的細胞群，生成細胞譜系發(fā)育樹，可用于預測細胞的分化及發(fā)育軌跡。
snRNA-seq分析顯示，與原代肝細胞snRNAseq數(shù)據(jù)集相比， mZ-HLO中的實質細胞群體（除肝母細胞群體）分區(qū)與肝細胞群體高度一致。軌跡分析揭示肝臟分區(qū)源于肝母細胞，肝臟再生過程中，2區(qū)肝細胞各分區(qū)肝細胞的主要來源。
3.3多區(qū)肝臟類器官實驗報告信息與歐盟MIAOU標準的對比
我們按歐盟MIAOU標準要求，將《用人多能干細胞生成的多區(qū)肝臟類器官》可利用的全部信息生成了包含5方面內容的多區(qū)肝臟類器官實驗元素據(jù)報告表。
歐盟MIAOU標準要求的元數(shù)據(jù)信息 | Nature多區(qū)肝臟類器官實驗報告信息 |
Section 1. Identification Of The Project | |
Project Title | XX |
Acronym Of The Project (if any) | - |
Type of Organoid | |
Organoid for Basic Research | 是 |
Factoroid (Organoid for Bioproduction) | 否 |
Organoid or Preclinical Research | 否 |
Organoid for Clinical Use | 否 |
Others (If Yes, Specify) | - |
Name of The Organoid | 人多分區(qū)肝臟類器官 |
Purpose of The Project | 作為人類肝臟體外細胞模型用于與肝臟發(fā)育和疾病相關的基礎研究 |
Section 2. Source Material | |
Does your research involve human material? | 是 |
If YES： | |
Is the material obtained from volunteers? | 是 |
Has informed consent been obtained? | 是 |
Provide details of the informed consent: | N.A. |
Is the volunteer a patient? | 是 |
Is the genetic identity at arrival known? | 是 |
If starting material is obtained from a biopsy, are descriptors known (gender, age, anatomical regions, diagnosis, viral status, etc.)? | 是 |
Please list items. | 性別: 男性 年齡: N.A. 取材所屬解剖區(qū)域：包皮環(huán)切術后廢棄包皮組織 患者病情臨床診斷：N.A. 病毒感染狀態(tài)：N.A. |
Does the sponsor of the research hold clinical data on the patient? | 是 |
Is the laboratory authorised to prepare and conserve human body elements for scientific purposes? | 是 |
Give details and references of the collection declaration. | N.A. |
Is the starting material a cell line? | 否 |
If YES： | |
Is the genetic identity at arrival known? | 是 |
Please specify (DNA sequence, SNPs, PCR, STR, CGH array, etc.) | 京都大學贈送的1383D6和RCL-BC iPSC：N.A. 患者包皮成纖維細胞誘導的72.3 和 72.3-GFP iPSCs：N.A. |
Is there genetic quality control (karyotype, STR, PCR, etc.)? | N.A. |
Please describe. | / |
Is the cell line functionally validated (differentiation test for pluripotency of iPSC, permeability test for epithelial cell, etc.)? | N.A. |
Please describe. | / |
Is the cell identity validated after X passages? | N.A. |
Specify X. | N.A. |
Are cell type markers identified (example: marker name, detection method, target value)? | N.A. |
Please list. | / |
Is the number of passages at arrival known. | N.A. |
Is the number of possible, or required, passages before the genesis of organoids defined? | / |
Are the storage conditions known? | 是 |
Please describe preservation protocol (culture, freezing, thawing protocol, storage modalities) | 見原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Does the material contain mutations (genetic disease)? | N.A. |
Is the sanitary status known? | N.A. |
Please give details of tests (mycoplasma, bacteriological, fungal, etc.) | N.A. |
Is the starting material primary cells from patients? | 是 |
If YES： | |
Is the genetic identity at arrival known? | 是 |
Please specify (DNA sequence, SNPs, PCR, STR, CGH array, etc.) | N.A. |
Is there genetic quality control (karyotype, STR, PCR, etc.)? | N.A. |
Please describe. | / |
Is the cell line functionally validated (differentiation test for pluripotency of IPSC, permeability tests for epithelial cell, etc.). | N.A. |
Please describe. | / |
Is the cell identity validated after X passages? | N.A. |
Specify X. | / |
Are cell type markers identified (e.g. marker name, detection method, target value)? | N.A. |
Please list. | / |
Is the number of passages at arrival known? | 原代 |
Is the number of possible, or required, passages before the genesis of organoids known? | 原代 |
Are the storage conditions known? | 是 |
Please describe preservation protocol (culture, freezing, thawing protocol, storage modalities). | 見原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Does the material contain mutations (genetic disease)? | N.A. |
Is the sanitary status known? | N.A. |
Please give details of tests (mycoplasma, bacteriological, fungal, etc.) | N.A. |
Are the cell culture conditions precisely described? | 是 |
If YES： | |
Are the culture conditions well defined? | CO2培養(yǎng)箱工作參數(shù)：37℃、5% CO2和95%空氣 |
Provide details of culture conditions (composition of culture media, nature, origin and quantities of supplements used - e.g. glucose, serum, antibiotics, growth factors etc.) | 見原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Are the nature and treatment of the substrates well described? | 是 |
Are the seeding conditions well described? | 是 |
Is the frequency of media changes defined? | 是 |
Are O2/CO2 concentrations given? | 是 |
Provide details of the culture conditions | CO2培養(yǎng)箱工作參數(shù)：37℃、5% CO2和95%空氣 |
What are the storage conditions for the lines or cells? | -80℃超低溫保存 |
Are there cell master banks? | N.A |
Describe protocols and drift control. | N.A. |
Are there cell working banks? | 是 |
Describe protocols and drift control. | N.A. |
Are storage conditions indicated? | 見原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Describe the freezing and thawing protocol. | N.A |
Are the storage modalities given? | 見原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Please specify. | 同上 |
Section 3. Manufacturing of The Organoid | |
Does the project include 2D differentiation? | 是 |
If YES： | |
Provide details on culture media, nature, origin, supplements used (e.g. growth factors glucose, serum, antibiotics, CO2/O2 concentrations, etc.) | 見原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Describe the sequence and duration of differentiation treatments. | 同上 |
Are the culture substrates treated? | 同上 |
Describe the seeding conditions and frequency of media changes | 同上 |
Is there quality control for the differentiation process? | 同上 |
Provide details (e.g. morphology, material homogeneity, max and min confluence, proliferation, functional test, monitoring of markers, possible sorting, mortality rate). | 形態(tài)學：N.A.;材料均勻性：N.A;最大和最小匯合：N.A. 細胞增殖：N.A. 功能測試：N.A.;標記物監(jiān)測：N.A. 細胞的分類：N.A.;細胞死亡率：N.A. |
Does the project include the generation of (3D) organoids? General considerations | 是 |
If YES： | |
Provide details on culture media, nature, origin, supplements used (e.g. growth factors glucose, serum, antibiotics, CO2/O2 concentrations, etc.). | 見原文[Method]“Organoid generation、Generating multi-Zonal Human Liver Organoids with zonal diversity” |
Describe the sequence and duration of differentiation treatments | 同上 |
Are the culture substrates treated? | 同上 |
Describe the seeding conditions and frequency of media changes. | 同上 |
Is there quality control for the differentiation process? | 同上 |
Provide details (e.g. morphology, material homogeneity, max and min confluence, proliferation, functional test, monitoring of markers, possible sorting, mortality rate). | 形態(tài)學：N.A.，材料均勻性：N.A. 最大和最小融合度：N.A.，細胞增殖：N.A. 功能測試：見原文[Method]一節(jié) 標記物監(jiān)測：見原文[Results]“Multi-Zonal Human Liver Organoids via assembly of Z1- and Z3-HLOss” 細胞的分類：見原文[Results]“snRNAseq of mZ-HLOs reveal features of zonal hepatocytes” 細胞死亡率：N.A. |
Does organoid generation make use of matrices? | 是 |
If YES： | |
Describe the nature of the matrix (matrigel, hydrogels, hyaluronic acid, human decellularized matrix, etc.) | 見原文[Method]“Organoid generation、Generating multi-Zonal Human Liver Organoids with zonal diversity” |
Give the matrix concentration. | 同上 |
Give details of the preparation method (temperature, polymerization time, drop or layer structure, etc.). | 同上 |
Give the seeding density per matrix volume unit. | 同上 |
Specify the volume and number of drops of matrix per unit area in the culture medium. | 同上 |
Specify the amount of medium depending on the size of the well. | 同上 |
Describe the matrix dissociation method for organoid recovery. | 同上 |
Describe the organoid dissociation method used for their expansion. | 同上 |
Does the culture include multiple cell types? | 是 |
If YES： | |
Describe the sequence for co-culturing and adaptation of the co-culture media. | 見原文[Method]“Organoid generation、Generating multi-Zonal Human Liver Organoids with zonal diversity” |
Indicate the proportions of cell types. | 見原文[Results]“snRNAseq of mZ-HLOs reveal features of zonal hepatocytes” |
Section 4. Organoid Characterisation | |
Has a morphological/structural characterisation been performed? | 是 |
If YES： | |
Describe the appearance, size, shape [circularity, tubularity, regularity of contours (budding), etc.]. | 熒光顯微鏡 BZ-X810成像，用Fiji（v1.53f）對圖像進行形態(tài)測量和測定 |
Evaluate opacity/ refringency. | N.A. |
Quantify intra and inter-organoid homogeneity. | N.A. |
Give details of expected morphological, architectural and ultrastructural features, and organisation of cell types (identity, proportions, distribution). | 1）形態(tài)、結構和超微結構特征：N.A. 2）細胞組成類型、比例：SERPINA1 肝細胞 (55%)、KRT7 膽管細胞(11%)、PECAM1 內皮細胞(12%)、LYZ 巨噬細胞(7%)、COL1A1 星狀細胞(7%)和 CD44 間充質細胞(8%) |
Has a molecular characterisation been performed? | 是 |
If YES： | |
Provide elements of genomics, transcriptomics, metabolomics, proteomics. | 轉錄組學檢測元數(shù)據(jù)：RT-qPCR, RNA-seq, snRNA-seq 表觀遺傳學檢測元數(shù)據(jù)：ChiP-qPCR、ChIP-seq |
Indicate expected specific molecular markers, epigenetic characteristics. | 特異性分子標記物：見原文Fig. 1g. 表觀遺傳特征：RNA-seq、ChIP-seq 和 snRNA-seq 數(shù)據(jù)已存入GEO，登錄號GSE222654。 |
Has a functional characterisation been performed? | 是 |
If YES： | |
What are the qualitative and (if possible) quantitative functional characteristics? | 見原文[Method]一節(jié) |
If treatments are applied, detail the treatment protocol, response to treatments (pharmacological, chemical, physical, hormonal, etc.), and evaluation (quantitative or qualitative). | 見原文[Method]“Zonal toxicity assay”、Extended Data Fig. 11. |
Are traceability and organoid drift evaluated? | 是 |
If YES： | |
Describe how the traceability of components is evaluated (batches, suppliers etc., environments, complements). | 見原文[Method] “mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance、Organoid generation、Generating multi-Zonal Human Liver Organoids with zonal diversity” |
Indicate criteria for the traceability of conditioned media (drift of cells used for conditioning, control of lines, such as those at the origin of the organoid) control of at least one of the growth factors). | 同上 |
Describe the qualitative drift criteria (morphological, structural, functional, molecular, etc.) specific to each organoid. Specify indices if applicable. | N.A. |
How is robustness evaluated (same starting cells, same organoid)? Specify indices if applicable. | N.A. |
Section 5. Use Of Organoids | |
Are the organoids designed for basic research? | 是 |
If YES： | |
Is compliance with GLP required for organoid production? | 否 |
Give details, if applicable. | / |
與歐盟MIAOU標準的對照顯示，多區(qū)肝臟類器官一文所披露的類器官實驗元數(shù)據(jù)并不完善。表中凡標記為N.A.的條目，不查閱作者公開發(fā)表的其它類器官研究報告等外部材料情況下，單從該報告是無法獲知詳情的。
為確保類器官實驗起始材料的性狀一致性，MIAOU標準的“Section 2材料來源”部分對干細胞材料要求提供接收時干細胞傳代（passages）的代數(shù)、細胞系分子遺傳信息、生物標志物及是否經過干細胞多能性驗證的信息。此外，在培養(yǎng)維持干細胞材料時，規(guī)定要注明樣品經過支原體/細菌學/真菌感染檢測陰性的結果。然而在多區(qū)肝臟類器官一文中，讀者除根據(jù)常識可以判斷人體材料捐獻者系男性，為陰莖包皮環(huán)切術廢棄組織外，患者年齡、手術時疾病診斷信息、是否有遺傳病及病毒感染等MIAOU標準規(guī)定信息都無從可考。合作單位惠贈的iPSCs的傳代（passages）的代數(shù)、細胞系遺傳信息、生物標志物等信息及查詢途徑均未作說明，對細胞培養(yǎng)過程中樣品及培養(yǎng)環(huán)境是否經支原體/細菌學/真菌感染檢測為陰性結果亦無明確備注。
“Section 3 類器官的生成”部分，無論是細胞2D培養(yǎng)、3D培養(yǎng)操作過程，缺少傳代操作的時細胞融合度范圍區(qū)間、細胞計數(shù)結果（從活細胞比率可計算出死細胞比率）等重要信息。此外，未對倒置顯微鏡相差模式下的細胞形態(tài)提供必要文字說明，也無超微結構（一般指的是電鏡圖片）特征信息描述。“Section 4 類器官的表征”工作，只提供了細胞標志物熒光圖像資料，缺少對具有質控意義的細胞功能、活力和表觀遺傳學特征指標的明確說明。
多區(qū)肝臟類器官一文研究團隊有十余年類器官研究的成功經驗。如此雄厚技術實力背景下，報告中出現(xiàn)MIAOU標準中規(guī)定的類器官材料元數(shù)據(jù)要素的缺失，顯然絕非實驗資源條件受限所致，而應歸結為研究團隊對類器官實驗操作和實驗過程質量控制標準化內部要求與歐盟MIAOU標準規(guī)范的不一致。這也恰恰反映了當今的歐盟、美國和日本乃至全球科學界，在類器官研究技術標準不統(tǒng)一的現(xiàn)狀。
另一方面，通過對照也反映出歐盟MIAOU標準自身的技術局限性。
一是其中部分環(huán)節(jié)質控標準設置值得商榷。特定的原代細胞、誘導多能性干細胞株，在不同培養(yǎng)維持和誘導條件、多次傳代操作過程中，與其說要注意防范基因突變發(fā)生的風險，不如重點關注細胞因培養(yǎng)環(huán)境改變后細胞表觀遺傳學特征偏差的可能性。以本文所討論的研究項目為例，相同遺傳背景的肝臟類器官在不同化合物誘導處理后，細胞基因表達表現(xiàn)出明顯的空間差異化特征。文中沒有提供任何的細胞基因組、關代謝相關功能基因序列或STR測試數(shù)據(jù)信息。因此，規(guī)定所有實驗環(huán)節(jié)所用的細胞材料須提供DNA序列、SNP分析、PCR檢測、STR位點等基因序列信息作為質控標準就不盡合理，給研究工作平添額外開支和工作負擔。此外，實驗前須進行iPSC多能性分化實驗或上皮細胞滲透性實驗，不僅會消耗部分寶貴的細胞材料資源，還會造成本已耗時冗長的類器官培養(yǎng)時間進一步拉長。因此，MIAOU標準應該仿照實時熒光定量PCR實驗報告的MIQE指南，對列出的要素信息按其重要程度實施分級管理，可能更合理和具有可行性。
其二，MIAOU標準，視乎主要是針對常規(guī)類器官、類器官芯片而設置的。盡管HYBRIDA項目已將的類器官組裝體、嵌合型類器官納入監(jiān)管視線，但目前看，并不能完全適應更復雜的類器官組裝體操作、表征和質控管理的要求。
這么一說，我們真有點期待歐盟的MIAOU 2.0標準了。
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